Transformando Modelos de Tecidos de Barreira Estática em Sistemas Microfisiológicos Dinâmicos

As barreiras vasculares servem como uma interface crítica que separa o compartimento sanguíneo do tecido circundante. Desempenham papel fundamental na preservação da homeostase, atraindo células imunes, controlando a permeabilidade molecular e blindando contra a intrusão de patógenos no tecido ^1,2. Modelos de cultivo in vitro têm sido desenvolvidos para mimetizar o microambiente in vivo, permitindo investigações sistemáticas sobre os fatores e condições que afetam as propriedades de barreira tanto em estados saudáveis quanto doentes ^3,4.

A abordagem mais utilizada para tais modelos de cultura é a configuração Transwell-like "open-well"⁵, onde uma membrana de cultura porosa e condicionada por trilhos separa compartimentos preenchidos por meios (Figura 1A). Neste formato, as células podem ser semeadas em ambos os lados da membrana, e uma ampla gama de protocolos experimentais foi desenvolvida. No entanto, esses sistemas são limitados em sua capacidade de fornecer os fluxos de fluidos essenciais para suportar a maturação da barreira e mimetizar a circulação de células imunes observadas in vivo ^5,6. Consequentemente, não podem ser utilizados para estudos que necessitem de fluxos dinâmicos que introduzam doses de fármacos, estimulação mecânica ou tensões de cisalhamento induzidas por fluidos ^6,7,8.

Para superar as limitações dos sistemas de poço aberto, plataformas microfluídicas que combinam membranas de cultura porosas com canais fluídicos endereçáveis individualmente foram desenvolvidas⁹. Essas plataformas oferecem controle preciso sobre o roteamento de fluidos, perfusão e introdução de compostos químicos, estimulação de cisalhamento controlada e capacidade de adição dinâmica de células 7,10,11,12,13. Apesar das capacidades avançadas proporcionadas pelas plataformas microfluídicas, elas não têm sido amplamente adotadas nos laboratórios de biociências devido aos complexos protocolos microfluídicos e sua incompatibilidade com fluxos de trabalho experimentais estabelecidos4,10,14.

Para preencher a lacuna entre essas tecnologias, apresentamos um protocolo que emprega um sistema baseado em módulos reconfigurável magneticamente. Este sistema pode ser facilmente alternado entre os modos de poço aberto e microfluídico com base nas necessidades específicas do experimento. A plataforma possui um dispositivo de poço aberto, conhecido como m-μSiM (sistema microfisiológico modular habilitado por uma membrana de silício), com uma membrana de cultura de 100 nm de espessura (nanomembrana). Esta nanomembrana possui alta porosidade (15%) e transparência semelhante a vidro, como ilustrado na Figura 1B. Ele separa fisicamente o compartimento superior de um canal inferior, permitindo o transporte molecular através de escalas de comprimento fisiológico¹⁵. Ao contrário das membranas convencionais gravadas por trilhos, que têm desafios conhecidos na obtenção de imagens de células vivas com imagens de campo claro, as propriedades ópticas e físicas favoráveis da nanomembrana permitem a visualização clara das células em ambos os lados da superfície da membrana 15,16,17.

O presente protocolo descreve a fabricação de módulos especializados de semeadura e fluxo e explica a reconfiguração magnética da plataforma. Isso demonstra como a plataforma pode ser empregada para estabelecer barreiras endoteliais em condições estáticas e dinâmicas. Esta demonstração revela que as células endoteliais alinham-se ao longo da direção do fluxo, com uma upregulation de alvos gênicos sensíveis ao cisalhamento sob estimulação de cisalhamento.

Este projeto pode ser usado em vários modos com base em requisitos experimentais e nas preferências do usuário final. Antes de cada experimento, consulte o fluxograma de decisão apresentado na Figura 2 para determinar as etapas e módulos necessários para o protocolo. Por exemplo, se o usuário pretende manter o formato de poço aberto durante um experimento para compará-lo diretamente com o sistema do tipo Transwell, o estêncil de padronização não é necessário para a semeadura de células. O módulo central está disponível comercialmente (consulte Tabela de Materiais), e a nanomembrana ultrafina pode ser selecionada de uma biblioteca de materiais com diferentes porosidades e tamanhos de poros para atender às necessidades experimentais.

1. Fabricação do estêncil de padronização

NOTA: O estêncil de padronização serve para posicionar as células exclusivamente na região porosa do chip de membrana, impedindo que as células se instalem na camada de silício circundante, onde poderiam sofrer danos após a adição do módulo de fluxo¹⁶ (consulte a Figura 3). Danos à monocamada podem afetar adversamente a integridade da barreira e comprometer os resultados experimentais. O estêncil é desnecessário em uma cultura aberta e estática, pois não há risco de danos.

1. Compre, usine ou imprima um molde em 3D usando o design fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 1 (Figura 4A).
   NOTA: As paredes do estêncil são cônicas para aumentar a capacidade da mídia e minimizar o aprisionamento de bolhas em comparação com os recursos de parede reta de alta taxa de aspecto.
2. Anexe um filme adesivo sensível à pressão (PSA) de 130 μm a uma folha de acrílico de 3,2 mm usando um rolo frio (consulte a Tabela de Materiais).
3. O corte a laser da folha de acrílico de acordo com o projeto fornecido no Supplementary Coding File 2 para criar uma matriz de cavidades (Figura 4B).
4. Retire a camada protetora da película de PSA e prenda a folha de acrílico ao molde.
   NOTA: Certifique-se de que a folha cortada a laser esteja alinhada com o molde de modo que as características do molde estejam centralizadas dentro da cavidade (Figura 4C). A precisão do posicionamento celular na membrana depende dessa etapa.
5. Misture completamente o pré-polímero PDMS (usando uma proporção de base para catalisador de 10:1) (consulte a Tabela de Materiais) e desgaseifique-o em uma câmara de vácuo até que não restem bolhas visíveis (5-15 min).
6. Despeje lentamente o PDMS nas cavidades do molde, nivelando-o com uma borda plana.
   NOTA: Para evitar o aprisionamento de bolhas, despeje o PDMS em cada cavidade lentamente. Se houver bolhas após o derramamento, coloque o molde na câmara de vácuo e desgaseifique-o novamente.
7. Curar o PDMS numa placa de aquecimento a 70 °C durante 1 h e, em seguida, deixá-lo arrefecer até à temperatura ambiente.
8. Extrair os estênceis das cavidades do molde usando pinças de ponta plana.

2. Fabricação do módulo de fluxo

NOTA: O módulo de fluxo compartilha uma pegada semelhante com o poço em forma de trevo do módulo central e inclui um microcanal moldado (largura = 1,5 mm, altura = 0,2 mm, comprimento = 5 mm). A forma do trevo auxilia no alinhamento do canal sobre a região de cultura porosa (Figura 5).

1. Use técnicas padrão de litografia suave¹⁸ para criar um molde de silício com características definidas pelo projeto fornecido no Supplementary Coding File 3 (Figura 4D).
2. Anexe um filme PSA de 130 μm a uma folha de acrílico de 3,2 mm de espessura.
3. O corte a laser da folha de acrílico com base no desenho dado no Arquivo de Codificação Suplementar 4 para criar uma matriz de cavidades em forma de trevo (Figura 4E).
   NOTA: A altura da cavidade determina a altura do módulo de fluxo, que deve ser ligeiramente mais alto (por 0-0,1 mm) do que a altura do poço do módulo central para garantir a vedação adequada.
4. Remova a camada protetora da película PSA e, em seguida, conecte a folha cortada a laser ao molde de silicone alinhando as marcas de alinhamento triangular no molde de silicone com as da folha cortada a laser.
   NOTA: Semelhante ao passo 1.4, certifique-se de que a folha de acrílico cortada a laser esteja alinhada com o molde de silicone de modo que as características do molde estejam centralizadas dentro de cada cavidade (Figura 4F). Esta etapa determina a posição do microcanal em relação à pegada.
5. Despeje lentamente o PDMS desgaseificado nas cavidades do molde e nivele-o com uma borda plana.
   NOTA: Se houver bolhas após o derramamento, desgaseifique o molde até que as bolhas sejam removidas.
6. Coloque o molde em uma placa de aquecimento e asse o PDMS a 70 °C por 1 h, em seguida, deixe o molde esfriar até a temperatura ambiente.
7. Remova cuidadosamente os módulos de fluxo das cavidades do molde usando pinças de ponta plana.
8. Orientar o módulo de fluxo com as características do microcanal voltadas para cima e posicionar as portas de entrada e saída do núcleo no final do canal usando um punção de biópsia (consulte a Tabela de Materiais).

3. Fabricação de carcaças de acrílico inferior e superior

NOTA: O módulo principal se encaixa na carcaça inferior. A atração entre ímãs embutidos nas carcaças comprime e sela o módulo de fluxo para o módulo central (Figura 6).

1. Corte a laser uma folha de acrílico de 2 mm usando o design fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 5 para criar a carcaça superior com furos para inserção de ímã.
2. Fixe um filme PSA de 130 μm a uma folha de acrílico de 3,5 mm.
3. Corte a laser a folha de acrílico com base no design dado no Arquivo de Codificação Suplementar 6 para criar a carcaça inferior com furos para inserção de ímã.
   NOTA: A espessura da carcaça inferior é um parâmetro crítico e deve corresponder à espessura total do módulo central para evitar fugas durante o fluxo.
4. Remova a camada protetora PSA e fixe a carcaça inferior a uma tampa de vidro.
5. Encaixe ímãs de neodímio niquelados de 4,75 mm (ver Tabela de Materiais) nos orifícios cortados a laser das carcaças.
   NOTA: Certifique-se de que os ímãs nas caixas inferior e superior sejam colocados com polaridade oposta para garantir a atração magnética (Figura 6).

4. Fabricação do circuito de fluxo

NOTA: O circuito de fluxo em circuito fechado contém dois frascos de coleta de amostras como reservatórios (Figura 7). O reservatório de entrada possui um filtro de difluoreto de polivinilideno (PVDF) para permitir que o meio celular se equilibre com a concentração de CO₂ na incubadora.

1. Use um punch de biópsia de 1 mm para criar dois orifícios na tampa de um frasco de coleta de amostra.
2. Use punções de biópsia para criar dois orifícios (1 mm e 4 mm) na tampa de um frasco de coleta de amostra separado e crie um orifício de 1 mm na parte inferior deste frasco.
3. Insira pontas dosadoras de 20 G em cada um dos orifícios de 1 mm e seque-os com cola quente.
4. Coloque um filtro PVDF de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais) no orifício de 4 mm e sele com cola quente.
5. Corte a laser uma folha de acrílico de 1,5 mm usando o design fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 7 para criar um estágio de retenção de amostra.
6. Posicione os reservatórios sobre o palco de acrílico.
7. Conecte as pontas de dosagem usando tubos de microfluxo (consulte a Tabela de Materiais).
8. Conecte os tubos à entrada e saída do módulo de fluxo usando ponteiras dosadoras de 21 G.
9. Utilize uma bomba peristáltica (consulte a Tabela de Materiais) para a circulação do fluxo.
   NOTA: Bombas de seringa ou pneumáticas também podem ser usadas para introduzir fluxo, se desejado. O caudal deve ser determinado com base nas necessidades experimentais. Uma tabela abrangente, derivada de um modelo COMSOL validado experimentalmente, é fornecida na Tabela Suplementar 1 para ajudar os usuários a selecionar a vazão necessária para atingir a tensão de cisalhamento desejada na monocamada celular¹⁶.

5. Semeadura celular

NOTA: Semelhante às inserções de membrana convencionais, diferentes tipos de células podem ser cultivados na nanomembrana. Um tipo celular secundário também pode ser co-cultivado do outro lado da membrana no canal inferior¹⁵.

1. Revestir a membrana com 5 μg/^cm2 de fibronectina (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente durante 1 h para melhorar a fixação celular.
   NOTA: O tipo de célula escolhido pode influenciar o revestimento necessário e a densidade celular. O procedimento descrito aqui é para células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs, ver Tabela de Materiais).
2. Aspirar a solução de revestimento usando uma pipeta P200 e colocar um estêncil de padronização no poço do módulo central.
3. Adicione mídia celular ao canal de poço e inferior do dispositivo.
4. Seme HUVECs a uma densidade de 40.000 células/cm² no poço.
   NOTA: HUVECs nesta densidade tipicamente formam uma monocamada confluente após 24 h de incubação^16,19.
5. Coloque o dispositivo em uma placa de Petri. Adicione uma tampa de tubo cônico de 15 mL com água DI à placa de Petri para manter a umidade local.
6. Transfira a placa de Petri para a incubadora.
   NOTA: A mídia celular no poço superior e no canal inferior do dispositivo deve ser trocada a cada 24 h. Para alterar a mídia no canal inferior, injete suavemente a mídia nova em uma das portas para deslocar a mídia antiga da outra porta.

6. Reconfiguração para modo microfluídico

1. Esterilize a carcaça superior, a carcaça inferior, o módulo de fluxo, reservatórios, tubos e pontas de dosagem, colocando-os em uma câmara de esterilização UV por 30 minutos antes da montagem. Circular etanol 70% e, em seguida, PBS estéril no circuito de fluxo.
2. Encher os reservatórios e tubos com meios de crescimento de células endoteliais (ver Tabela de Materiais).
3. Coloque a carcaça inferior no estágio de amostragem. Insira o módulo principal de poço aberto na caixa inferior.
4. Aspirar o meio celular do poço do módulo. Coloque o módulo de fluxo no poço.
5. Coloque a carcaça superior para selar bem o módulo de fluxo no módulo principal. Conecte as pontas dosadoras de entrada e saída às portas do módulo de fluxo.
6. Ligue a bomba peristáltica para introduzir o fluxo de fluido no sistema.

7. Realização de análise a jusante em formato de poço aberto após a introdução do fluxo

NOTA: O tempo de cultura aqui depende dos objetivos experimentais. Os usuários podem realizar análises a jusante (por exemplo, imunocitoquímica, extração de RNA) nos formatos de poço aberto ou microfluídico com base em sua preferência. Por exemplo, se preferir um formato de poço aberto, o sistema deve ser reconfigurado para conduzir ensaios baseados em protocolos padrão^16,19.

1. Pare a bomba quando o tempo desejado para exposição ao fluxo de cisalhamento for atingido. Remova as pontas dosadoras de entrada e saída.
2. Remova a carcaça superior. Remova suavemente o módulo de fluxo do poço usando uma pinça.
3. Adicione 100 μL de meio celular ao poço. Realizar ensaios desejados com base em protocolos padronizados.

O módulo central de poço aberto é inicialmente posicionado dentro de uma cavidade específica criada por uma carcaça inferior e uma lamínula, como ilustrado na Figura 6A. Posteriormente, o módulo de fluxo, que inclui um microcanal e portas de acesso, é inserido no poço do módulo principal. O módulo de fluxo é selado firmemente contra a camada de suporte de silício da membrana devido à força de atração magnética entre os ímãs embutidos nas carcaças inferior e superior, conforme ilustrado na Figura 6B. Para avaliar a eficácia desse mecanismo de travamento magnético, foi realizado um ensaio de pressão de ruptura, demonstrando que o sistema pode suportar pressões sem saída de até 38,8 ± 2,4 kPa. Essa tolerância à pressão excede significativamente as pressões de operação típicas encontradas em aplicações de cultura de células. Além disso, o sistema permanece livre de vazamentos quando submetido a vazões de até 4000 μL/min, o que equivale a uma tensão de cisalhamento de 74 dinas/cm2 na região de cultivo16.

Ao desenvolver uma plataforma que possa alternar entre os modos de poço aberto e microfluídico, deve-se considerar cuidadosamente a abordagem de semeadura celular, que não é tipicamente uma preocupação para plataformas estáticas convencionais de poço aberto16. Danos à monocamada ao redor do limite do canal poderiam introduzir complicações nos resultados experimentais20. Para resolver essa questão, foi projetado um estêncil removível que se encaixa no poço aberto do módulo central e fornece uma janela específica para que as células se depositem preferencialmente na superfície da membrana (Figura 3). Uma vez que a monocamada celular é padronizada e atinge a confluência, o usuário tem a flexibilidade de continuar o experimento no formato de poço aberto ou reconfigurar a plataforma em modo microfluídico para expor a monocamada celular à tensão fisiológica de cisalhamento (Figura 3). O mecanismo de travamento magnético fornece a capacidade de alternar facilmente entre os formatos de poço aberto e microfluídico, conforme necessário. Por exemplo, o dispositivo pode ser revertido para o formato de poço aberto após uma estimulação de fluxo, oferecendo aos usuários a flexibilidade de conduzir uma variedade de ensaios (como imunomarcação, extração de RNA e medidas de permeabilidade molecular) usando protocolos experimentais padrão15,16.

No cenário fisiológico do corpo humano, a barreira vascular é exposta ao estresse de cisalhamento induzido pelo fluxo, que serve como uma pista biofísica fundamental que afeta a estrutura e a função da barreira 5,21,22. Assim, a adição de fluxo de fluidos em sistemas microfisiológicos é um requisito fundamental. Para demonstrar a versatilidade da plataforma, uma monocamada HUVEC foi estabelecida em um formato de poço aberto usando protocolos padrão. Após 24 h de cultura estática, a plataforma foi reconfigurada em modo microfluídico para expor a monocamada celular a tensões de cisalhamento de 10,7 dinas/cm2 por 24 horas. Os resultados indicaram que as células cultivadas sob fluxo alinharam-se ao longo da direção do fluxo, enquanto as células cultivadas sem fluxo permaneceram aleatoriamente orientadas (Figura 8A,B). Após estimulação por cisalhamento, a plataforma foi reconfigurada para o formato de poço aberto para extração de RNA utilizando protocolos padrão. Os resultados indicaram que a exposição das células ao shear stress resultou na suprarregulação do fator Kruppel-like 2 (KLF2) e da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), que desempenham funções críticas como funções antitrombóticas e ateroprotetoras em vasos sanguíneos saudáveis 23,24 (Figura 8C).

Figura 1: Comparação de modelos de barreira vascular in vitro . Ilustração esquemática de (A) pastilhas convencionais do tipo Transwell e (B) do poço aberto m-μSiM. Imagens de campo brilhante de uma monocamada HUVEC confluente destacam a diferença na qualidade de imagem de campo brilhante entre uma membrana gravada em trilha e uma nanomembrana ultrafina. Barras de escala = 100 μm. Adaptado de Mansouri et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fluxograma de tomada de decisão. Um fluxograma baseado nas necessidades experimentais e preferências de análise a jusante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Fluxo de trabalho experimental da plataforma. (A) Para posicionar diretamente as células na membrana porosa, um estêncil padrão removível é inserido no poço do módulo central (o inset mostra células padronizadas, linhas amarelas exibem limites de microcanais). (B) O estêncil pode ser mantido ou removido no dispositivo para cultura celular estática. (C) Para reconfigurar a plataforma em modo microfluídico, o estêncil é substituído pelo módulo de fluxo. Devido ao mecanismo de vedação magnética, a configuração é reversível; As caixas e o módulo de fluxo podem ser removidos para mudar para o modo de poço aberto. Barra de escala = 200 μm. Adaptado de Mansouri et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Ilustração esquemática dos moldes. (A) O molde de estêncil. (B) Chapa acrílica cortada a laser. (C) visão montada do molde de estêncil. (D) Molde do módulo de fluxo. (E) Chapa acrílica cortada a laser. (F) Vista montada do molde do módulo de fluxo. Características em forma de triângulo são marcas de alinhamento para facilitar a fixação de folhas de acrílico aos moldes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Esquema do módulo de fluxo em forma de trevo. (A) A interface de contato entre o módulo de fluxo e o chip de membrana. As portas de entrada e saída para o fluxo de fluido são mostradas em rosa. (B) Imagem 3D do módulo de fluxo do PDMS. Adaptado de Mansouri et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Montagem magnética para reconfiguração do dispositivo. (A) Demonstração esquemática de componentes para reconfiguração do dispositivo em modo microfluídico. Ímãs embutidos com polos opostos induzem atração pela vedação. (B) Vista transversal do dispositivo reconfigurado mostrando o canal vascular em rosa e o compartimento tecidual em verde. Adaptado de Mansouri et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Vista montada do circuito de fluxo. O circuito é composto por uma bomba peristáltica, dois reservatórios para abastecimento de meios celulares e flutuações de amortecimento, tubulação e um estágio de acrílico para manter os componentes no lugar. Adaptado de Mansouri et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Comparação das HUVECs cultivadas nos modos poço aberto e microfluídico. As células foram semeadas e cultivadas em poço aberto por 24 h para estabelecer uma monocamada confluente. Durante o período subsequente de 24 h, um conjunto de dispositivos foi reconfigurado para o modo microfluídico. (A) Células cultivadas sob fluxo (tensão de cisalhamento de 10,7 dynes.cm-2 ) alinhadas ao longo da direção do fluxo (o inset mostra actina e núcleos das células em verde e azul, respectivamente). (B) Células cultivadas sem fluxo em poço aberto não apresentaram alinhamento. O comprimento das barras em gráficos de radar mostra o número de células na direção correspondente. (C) Células cultivadas sob fluxo apresentaram maior upregulation dos genes KLF2 e eNOS em comparação com a condição no-flow (**p < 0,01, n = 3, média ± DP). Barras de escala = 100 μm. Adaptado de Mansouri et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela suplementar 1: Tensão de cisalhamento na superfície da nanomembrana em diferentes vazões. Esta tabela fornece informações sobre os valores de tensão de cisalhamento na superfície da nanomembrana em várias taxas de fluxo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de Codificação Suplementar 1: Modelo CAD do molde de estêncil. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de Codificação Suplementar 2: Modelo CAD de cavidades de corte a laser para o molde de estêncil. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de Codificação Suplementar 3: Modelo CAD do módulo de fluxo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 4: Modelo CAD de cavidades de corte a laser para o molde do módulo de fluxo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de Codificação Suplementar 5: Modelo CAD da carcaça superior. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de Codificação Suplementar 6: Modelo CAD da carcaça inferior. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de Codificação Suplementar 7: Modelo CAD do estágio acrílico. Clique aqui para baixar este arquivo.

J.L.M. é co-fundador da SiMPore, Inc., e detém uma participação acionária na empresa. A SiMPore está comercializando as tecnologias à base de silício ultrafino, incluindo as membranas utilizadas neste estudo.