Isolamento imunomagnético das células-tronco CD34⁺ residentes na parede vascular de camundongos

A parede vascular desempenha um papel fundamental no desenvolvimento vascular, na regulação homeostática e na progressão de doenças vasculares. Nos últimos anos, vários estudos revelaram a presença de várias linhagens de células-tronco nas artérias. Em 2004, o grupo do professor Qingbo Xu relatou pela primeira vez a existência de células-tronco vasculares / progenitoras na periferia da parede vascular adulta, expressando CD34, Sca-1, c-kit e Flk-1¹. Essas células-tronco vasculares exibem potencial de diferenciação e proliferação multidirecional. Em condições normais, eles permanecem relativamente quiescentes; no entanto, quando ativados por fatores específicos, eles podem se diferenciar em células musculares lisas, células endoteliais e fibroblastos. Alternativamente, eles podem regular a formação da matriz perivascular e dos microvasos por meio de efeitos parácrinos para promover o reparo ou remodelamento dos vasos lesados 2,3,4,5,6. Recentemente, descobriu-se que as células-tronco CD34⁺ residentes na parede vascular desempenham um papel na regeneração das células endoteliais após lesão do fio-guia da artéria femoral². Consequentemente, o isolamento e a quantificação de VW-SCs CD34⁺ e o exame das características biológicas básicas das células-tronco CD34⁺ são cruciais para o estudo das vias de sinal envolvidas na regulação das VW-SCs CD34⁺.

Vários métodos de separação celular estão atualmente disponíveis, incluindo técnicas baseadas nas características da cultura celular ou propriedades físicas das células, como centrifugação por gradiente de densidade, que resulta em células classificadas contendo muitas células não-alvo e pureza relativamente baixa 7,8,9,10,11,12 . Outra técnica comumente usada é a classificação de células por fluorescência / magnética. A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) é um sistema complexo com altos requisitos técnicos, relativamente caro, demorado e potencialmente afeta a atividade das células selecionadas^13,14. No entanto, a classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) é mais eficiente e conveniente, com alta taxa de recuperação e atividade celular e menor impacto em aplicações a jusante⁸. Portanto, neste protocolo, aplicamos MACS para purificar CD34⁺ VW-SCs e identificamos as células por citometria de fluxo. O estabelecimento de métodos de isolamento baseados em MACS para estudar células-tronco da parede vascular seria inestimável. Em primeiro lugar, permite estudos experimentais genéticos e biológicos celulares. Em segundo lugar, o isolamento eficiente e a cultura de células-tronco residentes na parede vascular permitem a avaliação sistemática e a triagem dos fatores de sinalização que regulam as funções das células-tronco. Em terceiro lugar, a identificação de fenótipos cruciais em células-tronco fornece um importante "controle de qualidade" na avaliação do status celular. Assim, a identificação de métodos de purificação pode ser útil para aplicações semelhantes a células-tronco análogas derivadas de vasos.

Este relatório fornece uma demonstração detalhada de um método estável e confiável para a cultura de CD34⁺ VW-SCs, incluindo identificação celular e avaliação funcional realizada por citometria de fluxo, coloração por imunofluorescência e medição de sinalização de Ca²⁺ . Este estudo fornece uma base para pesquisas mais aprofundadas sobre a função dos CD34⁺ VW-SCs e seus mecanismos regulatórios em condições fisiológicas e patológicas.

Este estudo foi aprovado e os animais foram manejados de acordo com as Diretrizes para o Manejo e Uso de Animais de Laboratório na China. A pesquisa seguiu rigorosamente os requisitos éticos dos experimentos com animais, com aprovação do Comitê de Ética Animal (Número de Aprovação: SWMU2020664). Camundongos C57BL/6 saudáveis de oito semanas de idade, de ambos os sexos, pesando entre 18-20 g, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram alojados no Centro de Animais de Laboratório da Southwest Medical University (SWMU).

1. Cultura de blocos teciduais de adventícia da aorta e artérias mesentéricas

1. Isolamento de VW-SCs CD34⁺ residentes
   1. Anestesiar dois camundongos com inalação de isoflurano a 3% (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Confirme a anestesia adequada beliscando os dedos. Posicione o mouse em decúbito dorsal com fita adesiva e borrife desinfetante com etanol 70% para desinfetar o pelo do mouse. Abra as cavidades torácica e abdominal usando tesouras oftálmicas estéreis e fórceps para expor o coração e os intestinos. Depois de dissecar a aorta isolada e as artérias mesentéricas, prenda a aorta e o leito mesentérico em uma placa de Petri contendo elastômero de silicone e preenchido com uma solução salina fisiológica. Com outro conjunto de tesouras e pinças esterilizadas, disseque rapidamente a gordura ao redor da aorta e das artérias mesentéricas.
   2. Transfira os tecidos dissecados para uma placa de Petri de 6 cm contendo solução de penicilina-estreptomicina-anfotericina B a 1% (ver Tabela de Materiais). Depois de enxaguar duas vezes, transfira as artérias para uma capa de cultura de tecidos sob um microscópio estéreo.
   3. Corte as artérias longitudinalmente e use uma pinça fina para descascar a camada externa da aorta e o primeiro ramo das artérias mesentéricas. Transfira as camadas externas para uma placa de Petri de 3,5 cm contendo 0,1-0,2 mL de meio de cultura (consulte a Tabela de Materiais). Corte as camadas externas em pedaços minúsculos (cerca de 1 mm³).
   4. Transferir os pedaços de tecido para um balão T25 revestido com gelatina, assegurando uma distribuição uniforme no fundo do balão. Mantenha uma distância moderada entre os pedaços de tecido para facilitar o rastreamento e o crescimento das células. Colocar o balão verticalmente numa incubadora (37 °C, CO₂ a 5%) durante 3 h para permitir que blocos de tecido adiram ao fundo do balão.
   5. Após 3 h, adicione 5 mL de meio de crescimento com alto teor de glicose DMEM para submergir os blocos de tecido. Orientar horizontalmente o balão T25. Monitore a migração celular ao redor dos blocos de tecido por meio de um microscópio em intervalos de 3 dias.
      NOTA: O meio deve conter 20% de soro fetal bovino, 0,2% de Fator Inibidor de Leucemia (LIF), 0,2 mM de β-Mercaptoetanol e 1% de penicilina/estreptomicina (ver Tabela de Materiais). O soro fetal bovino suporta a proliferação celular, enquanto o LIF e o β-mercaptoetanol impedem a diferenciação celular ^7,8.
   6. Quando as células no frasco T25 atingirem cerca de 80% de confluência, passá-las e cultivá-las em um ou dois frascos T75. Subcultive as células em cinco passagens para garantir o crescimento e a saúde adequados.
2. Separação magnética de células-tronco CD34⁺ residentes
   1. Quando as células em um ou dois frascos T75 atingirem 80% de confluência, dissocie as células com tripsina e ressuspenda-as em 1 mL de tampão de triagem (2 mM EDTA e 0,5% FBS). Determinar o número de células (balão 10⁷/T75) e centrifugar a suspensão de células a 300 x g durante 5 min (à temperatura ambiente).
   2. Rejeitar completamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 98 μL de tampão de triagem por 10⁷ células totais. Adicione 2 μL de anticorpo CD34 (consulte a Tabela de Materiais). Misture bem e incube por 30 min a 4 ° C no escuro com agitação ocasional.
   3. Lave as células adicionando 2 mL de tampão de classificação e centrifugue a 300 x g por 10 min em temperatura ambiente.
   4. Remova o sobrenadante com cuidado e completamente e ressuspenda as células em 80 μL de tampão de classificação.
   5. Adicione 20 μL de MicroBeads Anti-FITC (por 10⁷ células totais, consulte a Tabela de Materiais) no tampão. Misturar bem pipetagem repetitiva e incubar durante 15 min a 4 °C no escuro com agitação intermitente.
   6. Lave as células duas vezes adicionando 2 mL de tampão e centrifugue a 300 x g por 5 min para repelir as células. Descarte o sobrenadante completamente e ressuspenda as células em 1 mL de tampão.
   7. Posicione uma coluna MS dentro do campo magnético de um separador apropriado, garantindo que um tubo de coleta (por exemplo, um tubo de centrífuga de 15 mL) seja colocado abaixo da coluna MS para coletar os componentes separados. (ver Tabela de Materiais). Enxágue a coluna com tampão de 500 μL e espere até que ela tenha passado completamente.
   8. Carregue a suspensão celular na coluna e colete o fluxo contendo células não marcadas no tubo de 15 mL.
   9. Remova a coluna do separador e coloque-a em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Introduza 500 μL de tampão na coluna e, em seguida, lave imediatamente as células marcadas magneticamente empurrando o êmbolo para dentro da coluna.
   10. Para aumentar a pureza das células CD34⁺ , a fração eluída pode ser enriquecida usando uma segunda coluna MS. Repita o processo de separação conforme mencionado acima. Avaliar a pureza das células triadas por citometria de fluxo.
       NOTA: Normalmente, 10% -20% de células CD34 ⁺ são obtidas, com cerca de 70% -80% de células negativas e aproximadamente 10% de perda devido a procedimentos de coloração e centrifugação.
   11. Para confirmar ainda mais a pureza das células-tronco CD34⁺ da parede vascular, identifique as células classificadas por citometria de fluxo. O presente estudo mostrou uma pureza de mais de 90%.

2. Identificação celular por imunofluorescência

1. Células de sementes em lamínulas (diâmetro 8 mm) pré-revestidas com gelatina a 0,04%.
2. Quando as células atingirem cerca de 60% -70% de confluência, enxágue duas vezes com PBS e fixe as células com paraformaldeído a 4% por 10 min.
3. Lave as células com PBS por 3 min (3 vezes) e permeabilize as células com 0,2% de Triton X-100 (em PBS) por 5 min em temperatura ambiente.
4. Lave as células com PBS por 3 min (3 vezes) e bloqueie a ligação não específica dos anticorpos com 5% de soro de burro (em PBS) por 1 h.
5. Remova o tampão de bloqueio segurando cada lamínula em sua borda com uma pinça e drenando-a em uma folha de lenço umedecido sem fiapos.
6. Incubar as células em anticorpos primários diluídos 100 vezes (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, ver Tabela de Materiais) em 1% BSA (em PBS) durante a noite a 4 ° C.
7. Transvase a solução e lave as células com PBS durante 3 min (3 vezes). Incube as células com anticorpo secundário marcado com Alexa Fluor 488 (1:200 em 1% BSA) (consulte a Tabela de Materiais) por 1 h em temperatura ambiente no escuro.
8. Realize a contracoloração de DAPI diluindo a solução estoque de DAPI a 0,5 μg / mL em PBS e incubando células por 5 min.
9. Enxágüe com PBS e sele as lamínulas com reagente antidesbotamento. Capture imagens sob o microscópio confocal de varredura a laser.

3. Diferenciação induzida e caracterização de VW-SCs CD34⁺

1. Semeie células-tronco CD34⁺ em uma densidade apropriada (40% -50% de confluência) em lamínulas e placas de 6 poços, respectivamente.
2. Induza a diferenciação orientada para células endoteliais de células CD34 ⁺ cultivando células em meio de cultura de células endoteliais EBM-2 (ver Tabela de Materiais) por 1 semana.
3. Induza a diferenciação orientada para células de fibroblastos de células CD34 ⁺ cultivando células em meio de cultura de células de fibroblastos FM-2 (ver Tabela de Materiais) por 3 dias.
4. Sujeitar as células indiferenciadas e diferenciadas à coloração por imunofluorescência (conforme mencionado na etapa 2) com excitação a laser de 488 nm e uma objetiva de 40x. Detectar a expressão de marcadores de células endoteliais (CD31, VWF) e marcadores de células de fibroblastos (PDGFRα, Vimentina) (ver Tabela de Materiais).
5. Dissocie as células com tripsina e obtenha o pellet celular por centrifugação (300 x g, 5 min, temperatura ambiente). Ressuspenda as células com 100 μL de tampão de classificação. Pré-incubar a suspensão celular com mAb anti-rato CD16/CD32 purificado (1 μg) (ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante 5 min.
6. Adicione 2 μL de anticorpo monoclonal APC anti-camundongo PE Rat CD34 (1:50), anticorpo monoclonal APC CD31 (PECAM-1) (2 μL, 1:50) e anticorpo monoclonal CD140a (PDGFRa) FITC (2 μL, 1:50) diretamente às células pré-incubadas na presença de Mouse Fc Block e incube ainda a 4 ° C por 15 min.
7. Lave as células duas vezes adicionando 2 mL de tampão e centrifugue a 300 x g por 5 min (temperatura ambiente) para repelir as células. Rejeitar completamente o sobrenadante e ressuspender as células em 300 μL de tampão. Coloque tubos de fluxo com células coradas em uma caixa de gelo pronta para citometria de fluxo.

4. Detecção de sinalização intracelular de Ca²⁺ em células-tronco CD34⁺ vasculares

1. Células-semente em lamínulas 10 h antes dos experimentos em uma densidade de até 70% de confluência.
2. Retire as lamínulas e cole-as no fundo de uma câmara personalizada com qualquer vaselina.
3. Lave as lamínulas uma vez com PBS, substitua por Fura-2 / AM (5 μM) na solução de Tyrode (NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, MgCl₂ 1,2 mM, glicose 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl₂ 2,4 mM) (ver Tabela de Materiais) e incube as células por 30 min no escuro.
4. Remova o corante tratando com a solução de Tyrode por 10 min para permitir a desesterificação do fura-2 / AM.
5. Monte a câmara no palco de um microscópio de fluorescência invertida equipado com um sistema de imagem de campo amplo contendo um monocromador e uma câmera CCD (consulte a Tabela de Materiais).
6. Abra a janela principal, vá para a caixa de diálogo Configurações de captura e a página da câmera e pressione o botão ao vivo para exibição de imagem ao vivo .
7. Escolha o tipo de imagem de fluorescência, defina os tempos de repetição de loop de 340 nm/380 nm, o tamanho da imagem e o tempo de exposição da câmera em 380 nm e 340 nm para obter o brilho ideal da imagem.
8. Tire instantâneos únicos e desenhe várias linhas à mão livre para circular as células com cores diferentes e predefinir a Região de Interesses (ROIs), indicando o plano de fundo como ROI 0.
9. Reedite um protocolo já incorporado na visualização da área de trabalho e crie uma nova área de trabalho.
10. Execute o protocolo e o "Fluorescência 340 nm div Fluorescência 380 nm (Cinética ao vivo)" exibirá o gráfico cinético online.
11. Na visualização numérica, uma planilha ficará visível, apresentando colunas de valores em escala de cinza e informações de tempo correspondentes. Exporte os dados da planilha usando a área de transferência.
12. Calcular F340 nm/F380 nm indicando alterações intracelulares de Ca²⁺ após subtrair a fluorescência de fundo (ROI 0).

Isolamento e purificação de CD34+ VW-SCs
A alta pureza dos VW-SCs CD34+ é obtida a partir da adventícia da artéria aórtica e mesentérica de camundongo por fixação tecidual e classificação de microesferas magnéticas. A porcentagem de células CD34+ na parede do vaso é geralmente de 10% a 30%. A citometria de fluxo confirma que a pureza das células CD34+ obtidas por classificação magnética de esferas é superior a 90% (Figura 1A). A coloração por imunofluorescência celular mostra que os VW-SCs CD34+ expressam predominantemente CD34, c-kit, Flk-1 e Ki-67, com uma expressão relativamente menor de Sca-1 (Figura 1B).

Diferenciação de CD34+ VW-SCs
Os VW-SCs CD34+ são capazes de se diferenciar em células endoteliais e fibroblastos in vitro. As células-tronco CD34+ podem ser induzidas a se diferenciar em células endoteliais com expressão aumentada dos marcadores de células endoteliais CD31 e VWF. Além disso, as células de fibroblastos diferenciadas mostraram morfologia fusiforme longa e expressão aumentada dos marcadores de fibroblastos PDGFRα e Vimentina (Figura 2A, B). Além disso, a citometria de fluxo também confirmou a capacidade de diferenciação das células; a porcentagem de células endoteliais CD34 + CD31 + após a diferenciação aumentou 1,5 vezes em comparação com as células indiferenciadas (Figura 2C), e a porcentagem de células fibroblásticas CD34 + PDGFRa + após a diferenciação aumentou 1,7 vezes em comparação com as células indiferenciadas (Figura 2D).

Caracterização da sinalização de Ca2+ em VW-SCs CD34+
A administração extracelular de ATP (10 μM) aumentou o nível intracelular de Ca2+ através da via de sinal mediada por receptores acoplados à proteína G (GPCR), e a tapsigargina (TG) inibiu a Ca2+ ATPase do retículo sarcoplasmático (SR) (SERCA) para esgotar os estoques intracelulares de SR Ca2+ e desencadeou a entrada de cálcio operada por armazenamento (SOCE). Além disso, a cafeína estimulou o aumento do [Ca2+]i ativando a liberação de Ca2+ mediada por receptores de rianodina (RyRs) (Figura 3).

Figura 1: VW-SCs CD34+ colhidos por cultura de tecidos e classificação de células ativadas magneticamente (MACS). (A) Avaliação por citometria de fluxo de VW-SCs CD34+ purificados. (B) Imagens representativas mostrando a expressão dos marcadores de células-tronco CD34, c-kit, Flk-1, Sca-1 e marcador de proliferação celular (Ki-67). Barras de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Detecção da capacidade de diferenciação multidirecional de CD34+ VW-SCs. (A) Imagens representativas mostrando a expressão dos marcadores endoteliais CD31 e VWF, e marcadores de fibroblastos PDGFRα e Vimentina em CD34+ VW-SCs antes da diferenciação. (B) Imagens representativas mostrando a expressão dos marcadores endoteliais CD31 e FVW, e dos marcadores de fibroblastos PDGFRα e Vimentina em CD34+ VW-SCs após a diferenciação. Barras de escala: 50 μm. A barra de escala inserida é de 10 μm. (C) A porcentagem de células endoteliais CD34 + CD31 + antes e depois da diferenciação medida por citometria de fluxo. (D) A porcentagem de células de fibroblastos CD34 + PDGFRa + antes e depois da diferenciação medida por citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Sinal de Ca2+ intracelular em VW-SCs CD34+ . (A) A curva representativa mostra o efeito do ATP (10 μM) na sinalização intracelular de Ca2+ . (B) A curva representativa mostra a liberação intracelular de Ca2+ induzida por TG (1 μM) do armazenamento de SR e o subsequente influxo extracelular de Ca2+ desencadeado pela depleção de Ca2+ após a readição de 2 mM de Ca2+. (C) Curva representativa mostrando sinalização intracelular de Ca2+ ativada por cafeína (10 mM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.