A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal de esclerose múltipla (EM), que compartilha com a doença humana uma resposta autoimune humoral robusta. Aqui, relatamos um protocolo ELISA simples e flexível para quantificar autoanticorpos no soro de camundongos imunizados com EAE.
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Artigo de método
Quantificação de anticorpos autorreativos em camundongos após encefalomielite autoimune experimental
Neste artigo
Resumo
Resumo
A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo de doença que recapitula o distúrbio autoimune esclerose múltipla (EM) em níveis histopatológicos e moleculares. A EAE é induzida pela imunização de animais experimentais por meio de injeção subcutânea de peptídeos curtos de mielina juntamente com adjuvantes específicos para aumentar a resposta imune. Como a contraparte humana, os camundongos EAE desenvolvem lesões desmielinizantes, infiltração de células imunes no sistema nervoso central (SNC), ativação da glia e lesão neuronal. Um corpo consistente de evidências também apóia um papel mecanicista para a disfunção das células B na etiologia da EM e da EAE. As células B podem servir como células apresentadoras de antígenos, bem como uma fonte primária de citocinas pró-inflamatórias e autoanticorpos. Na EAE, os anticorpos são gerados contra os peptídeos de mielina que foram empregados para induzir a doença. Foi demonstrado que esses autoanticorpos mediam a perda de mielina ou a reativação de células T patogênicas no SNC. Este artigo descreve um protocolo eficiente baseado em ELISA para quantificar autoanticorpos no soro de camundongos C57BL/6J imunizados com o peptídeo glicoproteína 35-55 de oligodendrócitos de mielina (MOG35-55). O método proposto serve como uma ferramenta poderosa para investigar a especificidade e a magnitude da resposta humoral aberrante no contexto da desmielinização autoimune.
Introdução
A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune crônica do sistema nervoso central (SNC) caracterizada por infiltração focal de células imunes no parênquima cerebral, quebra das bainhas de mielina que envolvem os axônios, ativação da glia e perda neuronal1. Além do papel bem estabelecido das células T patogênicas, várias linhas de evidência destacaram o envolvimento das células B na mediação da resposta autoimune contra o SNC. As células B sofrem expansão clonal no cérebro da EM e anticorpos contra componentes da mielina foram detectados em lesões desmielinizadas 2,3. A ativação seleti....
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Protocolo
Todos os procedimentos envolvendo camundongos foram realizados de acordo com as diretrizes experimentais aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da East Carolina University (IACUC). Camundongos fêmeas C57BL/6J do tipo selvagem entre 8 e 10 semanas de idade foram usados neste estudo. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais). A EAE foi induzida após relatórios publicados anteriormente 12,13,14.
1. Coleta de soro
- Eutanasiar o camundongo experimental p....
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Resultados
Para demonstrar a robustez do presente ensaio ELISA, o método foi testado em amostras de soro isoladas de uma coorte de camundongos fêmeas C57BL/6J 20 dias pós-imunização (dpi) com 100 μg de peptídeo MOG35-55 em adjuvante de Freund completo (CFA) seguindo um protocolo de indução EAE validado 12,13,14. Os animais também receberam 400 ng de toxina pertussis nos dias 0 e 2. Amostras de soro de animais simulados imunizados com tudo,.......
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Discussão
Aqui, um protocolo simples e eficiente baseado em ELISA foi relatado para quantificar com precisão a resposta humoral em um modelo animal relevante de patologia de EM. Este método foi recentemente empregado para descrever o novo papel da proteína ataxina-1 no controle dos níveis séricos de autoanticorpos no paradigma MOG35-55/C57BL6J EAE12. Nesse sentido, vários fatores devem ser levados em consideração, a fim de obter resultados consistentes e biologicamente significativos com esse método.
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R03NS131908) e pelo Departamento de Defesa por meio do Programa de Pesquisa de Esclerose Múltipla sob o Prêmio nº W81XWH-22-1-0517. Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são de responsabilidade do autor e não são necessariamente endossadas pelo Departamento de Defesa. Este estudo também foi apoiado por fundos de startups da East Carolina University.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringas de 1 mL | BD Biosciences | 309628 | |
| tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | Fisher | 05-408-129 | |
| Agulhas de 25 G | BD Biosciences | 305122 | |
| substrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) | Thermo Fisher | N301 | Armazenar em 4 ° C |
| Selos adesivos | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma | A7906 | Armazene em 4 ° C |
| C57BL/6J camundongos fêmeas | O Laboratório Jackson 000664 | Animais entre 8 e 10 semanas de idade devem ser usados para experimentos EAE | |
| Tubos criogênicos | Fisher | 10-500-25 | |
| Tesoura | Fisher S111022 | ||
| Tesoura de dissecção | Ferramentas de ciências finas | 14082-09 | |
| Tampão de revestimento ELISA | BioLegend | 421701 | Armazene a 4° C |
| Excel software | Microsoft | Analysis planilha | |
| Fórceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Loja em 4 ° C |
| Fonte de luz LED | Fisher | AMPSILED21 | |
| Leitor de microplacas | Fisher | 14-377-575 | |
| Biologia molecular grau água | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptídeo | EZBiolab | cp7203 | Armazene a -80 ° C |
| Pipeta multicanal | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes tesoura de mola | Ferramentas Fine Science | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp Placas de 96 poços | BioLegend | 423501 | |
| Agitador orbital | Fisher | 88-861-023 | |
| Forno | VWR | 445-0024 | |
| Tampão fosfato salino (PBS) | Thermo Centrífuga | Fisher 14190144 | |
| Solução Fisher | 75002441 | ||
| Stop | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
Referências
- Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. Multiple sclerosis. N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).
- Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
- Genain, C. ....
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Reimpressões e permissões
