Quantificação de anticorpos autorreativos em camundongos após encefalomielite autoimune experimental

A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune crônica do sistema nervoso central (SNC) caracterizada por infiltração focal de células imunes no parênquima cerebral, quebra das bainhas de mielina que envolvem os axônios, ativação da glia e perda neuronal¹. Além do papel bem estabelecido das células T patogênicas, várias linhas de evidência destacaram o envolvimento das células B na mediação da resposta autoimune contra o SNC. As células B sofrem expansão clonal no cérebro da EM e anticorpos contra componentes da mielina foram detectados em lesões desmielinizadas ^2,3. A ativação seletiva de células B periféricas no início da doença foi recentemente documentada, sugerindo um papel putativo para esse compartimento de células imunes também no início da doença⁴. O sucesso das terapias de depleção de células B, como anticorpos monoclonais anti-CD20, corrobora ainda mais a conexão mecanicista entre o funcionamento aberrante das células B e a desmielinização autoimune ^5,6. Do ponto de vista molecular, as células B podem contribuir para a doença por meio da apresentação de autoantígenos, secreção de citocinas pró-inflamatórias e produção de anticorpos autorreativos.

Vários modelos animais foram desenvolvidos para recapitular características específicas do fenótipo complexo da EM. Dentre eles, a encefalomielite autoimune experimental (EAE) é o paradigma in vivo mais amplamente utilizado e depende da imunização de animais experimentais com peptídeos curtos derivados de proteínas de mielina, como a glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) e a proteína básica de mielina (MBP)⁷. Animais imunizados com EAE desenvolvem uma patologia desmielinizante que se assemelha à SM em muitos aspectos, incluindo uma resposta humoral robusta contra o peptídeo encefalitogênico⁸. Por esse motivo, os estudos de EAE têm sido fundamentais para dissecar a função das células B e autoanticorpos no contexto da doença. Por exemplo, foi demonstrado que anticorpos específicos para MOG isolados de pacientes com EM podem agravar o curso clínico em modelos de EAE⁹. Notavelmente, o resíduo de prolina na posição 42 em MOG humano mostrou-se crítico para determinar a patogenicidade do autoanticorpo¹⁰. Mais recentemente, descobriu-se que os autoanticorpos específicos para MOG promovem a doença não apenas mediando a perda de mielina, mas também aumentando a reativação de células T autorreativas no SNC¹¹.

Considerando a importância das respostas de anticorpos na autoimunidade do SNC, este artigo apresenta um protocolo baseado em ELISA para medir eficientemente os níveis séricos de anticorpos autorreativos em camundongos C57BL/6J EAE imunizados com o peptídeo MOG35-55. Na primeira parte do protocolo, será descrito o método de coleta de soro por punção intracardíaca. Posteriormente, serão detalhados os procedimentos para configurar o ensaio ELISA e adquirir os dados. Por fim, será discutida a análise e interpretação dos dados.

Todos os procedimentos envolvendo camundongos foram realizados de acordo com as diretrizes experimentais aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da East Carolina University (IACUC). Camundongos fêmeas C57BL/6J do tipo selvagem entre 8 e 10 semanas de idade foram usados neste estudo. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais). A EAE foi induzida após relatórios publicados anteriormente 12,13,14.

1. Coleta de soro

1. Eutanasiar o camundongo experimental por asfixia com CO₂ ou overdose de isoflurano no ponto de tempo necessário (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) após induzir EAE via imunização MOG35-55.
   NOTA: O número total de camundongos e os pontos de tempo para a coleta de soro podem variar de acordo com o experimento específico.
2. Depois que a ausência de sinais vitais for confirmada pelo pinçamento do dedo do pé ou da cauda, coloque o camundongo em uma posição de decúbito dorsal em uma bandeja de dissecção e fixe os membros na posição com alfinetes ou fita adesiva. Oriente o corpo do rato para a fonte de luz LED (consulte a Tabela de Materiais) para iluminar o tórax do animal.
3. Pulverize o pelo do camundongo com etanol a 70% e faça uma incisão na linha média de 3-4 cm ao longo do abdômen, da pelve ao xifóide, usando a tesoura dissectorial, tomando cuidado para evitar quaisquer órgãos e vasos importantes (Figura 1A-C). Para facilitar o procedimento, use a pinça para agarrar a pele sobre o processo xifóide.
4. Corte o diafragma lateralmente e, em seguida, corte a caixa torácica anteriormente em ambas as bordas laterais usando a tesoura de mola, parando antes de atingir o esterno na linha média (Figura 1D). Dobre a aba da costela que foi criada sobre a cabeça do mouse para expor o coração (Figura 1E).
   NOTA: Cortar o esterno deve ser evitado, pois isso danificará as principais artérias torácicas adjacentes ao osso e reduzirá o volume de sangue que pode ser coletado.
5. Insira uma agulha de 25 G conectada a uma seringa de 1 mL no ventrículo esquerdo e colete o sangue puxando suavemente o êmbolo para trás (Figura 1F). Para facilitar a punção da agulha, segure suavemente o coração contra uma pinça.
   NOTA: Se o sangue não aparecer imediatamente na seringa, a agulha deve ser girada lentamente e um ângulo diferente deve ser testado. No entanto, esforços devem ser feitos para colocar a agulha corretamente na primeira tentativa para evitar a criação de orifícios desnecessários no coração por onde o sangue pode vazar.
6. Transfira o sangue para um tubo estéril de 1,5 mL e deixe-o coagular por 30 minutos em temperatura ambiente. Remover o coágulo por centrifugação a 2000 × g durante 20 min a 4 °C. Colete o sobrenadante, que representa a fração sérica, e armazene alíquotas de uso único em tubos criogênicos a -80 °C para testes futuros.

2. Ensaio ELISA

1. Ressuspenda o peptídeo MOG35-55 liofilizado (consulte a Tabela de Materiais) em água para obter um estoque de 10 mg / mL. Antes de iniciar o experimento, dilua o estoque para 10 μg / mL em tampão de revestimento (consulte a Tabela de Materiais) e pipete 100 μL / poço da solução final em uma placa de 96 poços. Selar a placa com uma película adesiva para evitar a evaporação e incubar a placa durante a noite a 4 °C.
   NOTA: Pelo menos 2 poços devem ser calculados para cada amostra e 2 poços adicionais também devem ser incluídos para um controle em branco.
2. Paralelamente, revestir o mesmo número de alvéolos com 100 μL/alvéolo de albumina de soro bovino (BSA) dissolvido em tampão de revestimento na concentração de 10 μg/ml. Esses poços adicionais servirão como controles de fundo.
   NOTA: Recomenda-se revestir com BSA os poços de controle, pois os tampões de revestimento e bloqueio têm composições diferentes. Observe que outros peptídeos encefalitogênicos (como PLP139-151 ou MBP84-104) podem ser usados como antígenos irrelevantes em alternativa à BSA.
3. No dia seguinte, lave a placa 3 vezes com 200 μL/poço de solução salina tampão fosfato suplementada com 0,05% de Tween 20 (PBS-T). Em seguida, adicionar 100 μL/poço de uma solução de bloqueio feita de BSA a 3% em PBS (sem Tween 20) e incubar a placa selada por 1 h a 37 °C em um forno de hibridização.
4. Lave a placa 3 vezes com 200 μL/poço de PBS-T. Diluir cada amostra de soro 1:100 em solução de bloqueio e adicionar 100 μL/alvéolo aos alvéolos revestidos com MOG35-55 e BSA. Adicione o mesmo volume de solução de bloqueio aos poços designados como brancos. Incubar a placa selada durante 2 h à temperatura ambiente, com agitação constante (250 rpm).
5. Lave a placa 3 vezes com 200 μL/poço de PBS-T. Dilua o anticorpo secundário conjugado com HRP (1:2000, consulte a Tabela de Materiais) em uma solução feita de 0,2% de BSA em PBS-T e adicione 100 μL/poço a todos os poços. Incubar a placa selada durante 1 h à temperatura ambiente, com agitação constante (250 rpm).
6. Lave a placa 3 vezes com 200 μL/poço de PBS-T. Adicione 100 μL / poço de substrato de 3,3 ', 5,5' tetrametilbenzidina (TMB) (consulte a Tabela de Materiais) a todos os poços e incube no escuro por 1-5 min, monitorando o desenvolvimento de uma cor azul.
   1. Pare a reação adicionando 100 μL / poço de solução de parada (consulte a Tabela de Materiais) e meça a densidade óptica (OD) em cada poço usando um leitor de placas ajustado em um comprimento de onda de 450 nm.
      NOTA: O substrato TMB deve ser equilibrado à temperatura ambiente por 30-60 minutos antes de adicioná-lo aos poços.

3. Análise dos dados

1. Preencha uma planilha do Excel com os valores de OD lidos da placa. Calcule a média dos valores de DO obtidos de poços duplicados (revestidos com MOG35-55 e BSA) para cada amostra.
2. Para cada amostra, subtrair o valor médio dos alvéolos revestidos com BSA do valor dos alvéolos revestidos com MOG35-55. Os valores corrigidos de fundo resultantes serão proporcionais à concentração de anticorpos anti-MOG35-55 nas diferentes amostras de soro.
   NOTA: Os poços em branco devem resultar em valores corrigidos em torno de 0.
3. Aplicar um teste estatístico não paramétrico, como o teste U de Mann-Whitney, para comparar os valores médios de DO entre duas condições experimentais. Inclua pelo menos 3 amostras independentes para cada condição.

Para demonstrar a robustez do presente ensaio ELISA, o método foi testado em amostras de soro isoladas de uma coorte de camundongos fêmeas C57BL/6J 20 dias pós-imunização (dpi) com 100 μg de peptídeo MOG35-55 em adjuvante de Freund completo (CFA) seguindo um protocolo de indução EAE validado 12,13,14. Os animais também receberam 400 ng de toxina pertussis nos dias 0 e 2. Amostras de soro de animais simulados imunizados com tudo, mas sem o peptídeo, serviram como controles negativos. Todos os camundongos EAE desenvolveram os primeiros sinais da doença entre 11-14 dpi e alcançaram em 20 dpi uma pontuação média de 2,6 ± 0,6 (erro padrão, SE) em uma escala de 0-6 (0, sem sinais; 1, diminuição do tônus da cauda; 2, monoparesia ou paraparesia leve; 3, paraparesia grave; 4, paraplegia; 5, quadriparesia; e 6, moribundo ou morte)12. Como esperado, as amostras EAE apresentaram valores de DO significativamente mais altos em comparação com as amostras controle (Figura 2). Esses dados confirmam a presença de uma resposta robusta de imunoglobulina IgG contra o peptídeo MOG no pico da doença.

Figura 1: Procedimento de punção cardíaca. (A-E) Imagens representativas do procedimento de toracotomia para acesso ao coração em camundongos adultos. (F) Imagem representativa do procedimento correto para inserção da agulha no ventrículo esquerdo do coração do camundongo. Estruturas anatômicas relevantes são indicadas em cada painel para facilitar a dissecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: ELISA de autoanticorpo de peptídeo MOG. Os níveis séricos de imunoglobulinas IgG anti-MOG35-55 foram testados em EAE e camundongos simulados imunizados 20 dias após a imunização (dpi) usando o protocolo ELISA relatado. Valores de DO consistentemente mais altos foram detectados nas amostras de EAE em comparação com os controles. Os dados são apresentados como médias ± EP (N = 3 por grupo). As diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo teste U de Mann-Whitney unicaudal, *P ≤ 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.