Imagem de folha de luz 4D da contração cardíaca do peixe-zebra

O peixe-zebra (Danio rerio) é um organismo modelo amplamente utilizado para estudar o desenvolvimento, fisiologia e reparo cardíaco devido à sua transparência óptica, tratabilidade genética e capacidade regenerativa 1,2,3,4. No infarto do miocárdio, enquanto alterações estruturais e funcionais impactam a ejeção cardíaca e hemodinâmica, limitações técnicas continuam dificultando a capacidade de investigar o processo dinâmico durante a regeneração cardíaca com alta resolução espaço-temporal. Por exemplo, os métodos de imagem convencionais, como a microscopia confocal, apresentam limitações em termos de profundidade, resolução temporal ou fototoxicidade para capturar as mudanças dinâmicas e avaliar a função contrátil cardíaca durante múltiplos ciclos cardíacos⁵.

A microscopia óptica representa um método de imagem de última geração que aborda com sucesso essas questões, varrendo rapidamente o laser através do ventrículo e átrio do coração, obtendo imagens detalhadas com resolução espaço-temporal aprimorada e efeitos foto-tóxicos desprezíveis 6,7,8,9,10,11.

Esse protocolo introduz uma estratégia de imagem abrangente que inclui a construção do sistema LSM, reconstrução de imagens 4D, rastreamento de células 3D e análise interativa para capturar e analisar a dinâmica dos cardiomiócitos em todo o coração durante vários ciclos cardíacos¹². O sistema de imagem personalizado e a metodologia computacional permitem rastrear a microestrutura miocárdica e a função contrátil em nível de célula única em larvas transgênicas de peixe-zebra Tg(myl7:nucGFP). Além disso, compostos de pequenas moléculas foram entregues nos embriões usando microinjeção para avaliar a lesão cardíaca induzida por drogas e a subsequente regeneração. Essa estratégia holística fornece um ponto de entrada para investigar in vivo as propriedades estruturais, funcionais e mecânicas do miocárdio em nível de célula única durante o desenvolvimento e regeneração cardíacos.

A aprovação para este estudo foi concedida pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade do Texas em Dallas, sob o número de protocolo #20-07. Tg(myl7:nucGFP) larvas^{transgênicas de} zebrafish 12 foram utilizadas para o presente estudo. Toda a aquisição de dados e pós-processamento das imagens foram realizadas utilizando-se softwares de código aberto ou plataformas com licenças de pesquisa ou educacionais. Os recursos são disponibilizados pelos autores mediante solicitação razoável.

1. Criação de peixes-zebra e microinjeção de embriões

Tempo: 2 dias

1. Manter e criar peixes-zebra adultos através de cuidados padrão e procedimentos de criação. Para métodos detalhados, consulte o relatório anterior¹³.
2. Realizar microinjeção seguindo protocolo estabelecido¹⁴. Para o presente estudo, a microinjeção foi realizada no estágio de 1-2 células (zigoto).
   NOTA: É crucial identificar com precisão este estágio para uma microinjeção eficaz e garantir a consistência do desenvolvimento. Durante o estágio de uma célula, uma pequena cúpula se forma no topo da gema, e este estágio normalmente dura aproximadamente 12 min. Ao progredir para o estágio de duas células, duas cúpulas adjacentes tornam-se visíveis, e esse estágio perdura por cerca de 45 min após a fecundação¹⁵. Informações mais detalhadas da construção do sistema podem ser encontradas em outros laudos ou^{protocolos12,16,17}.

2. Preparação e montagem de embriões/larvas de peixe-zebra

Tempo: 7 dias

1. Transferir embriões no 1 dia pós-fertilização (dpf) para água E3 com 0,2 mM 1-Fenil-2-tiouréia (PTU) (ver Tabela de Materiais) para evitar a formação de pigmentos.
2. Substitua o meio por água fresca E3 com PTU todos os dias até a obtenção de imagens de LSM.
3. Fotografe embriões ou larvas com o estereomicroscópio para registrar seu desenvolvimento nos momentos desejados entre 0 e 7 dpf.
4. Preparar tubos segmentados fluorados de etilenopropileno (FEP) com 2 mm de diâmetro interno para incorporação de larvas de zebrafish sob o sistema LSM¹².
   NOTA: O tubo FEP é utilizado para fixar a amostra com materiais correspondentes ao índice de refração que se assemelham muito ao meio circundante, como a água.
5. A partir de 3 dpf, transferir os peixes para uma solução de 150 mg/L de tricaína (MS-222) (ver Tabela de Materiais) para imobilizar os peixes antes da obtenção de imagens.
6. Preparar 0,8 % de agarose de baixo derretimento com 150 mg/L de tricaína e utilizar uma pipeta de transferência para mover os peixes anestesiados para a agarose depois de esta ter arrefecido à temperatura ambiente¹⁸.
7. Utilizar outra pipeta de transferência para montar o peixe com agarose em tubos de PEP (Figura 1).
   OBS: Para averiguar o estresse mínimo nos embriões em desenvolvimento, exames pré e pós-fixação da atividade cardíaca, como frequência cardíaca, foram realizados sob observação microscópica. Essas avaliações tiveram como objetivo identificar diferenças significativas antes e após a anestesia com tricaina. Um exame adicional da pele e da musculatura para irregularidades na estrutura cardíaca, como edema, também poderia ser realizado após a fixação. A concentração de tricaína também desempenha um papel crucial na imagem cardíaca¹⁹ e, portanto, a solução de tricaína na concentração de 150 mg/L foi utilizada para a obtenção de imagens de contração em larvas de zebrafish neste projeto. Embora a presente sincronização retrospectiva nos permita abordar os batimentos cardíacos irregulares²⁰, uma solução abrangente para a imagem 4D de arritmias cardíacas e imagens de longo prazo em peixes-zebra ainda está em desenvolvimento.

3. Instalação e configuração do sistema de imagem de folhas leves

Tempo: 3-14 dias

1. Construa um sistema LSM interno baseado em uma lente cilíndrica usando sistemas de laser de estado sólido bombeado por diodo de onda contínua (DPSS) em comprimentos de onda específicos, como 473 nm e 532 nm, como fontes de iluminação (Figura 2A).
2. Personalize os códigos de controle do LabVIEW (consulte Tabela de Materiais) para a sincronização do estágio de amostra translacional, iluminação de folhas de luz e exposição da câmera sCMOS para capturar sequências de imagens.
   OBS: Informações mais detalhadas da construção do sistema podem ser encontradas em outros relatórios ou protocolos 12,16,17. Incentivamos os grupos de pesquisa a buscar oportunidades de colaboração com laboratórios que possuam experiência estabelecida em imagens ópticas durante a construção de sistemas.

4. Preparação de imagens de peixe-zebra e coleta de dados

Horário: 1 dia

1. Calibre a resolução espacial do sistema LSM e minimize a variação de opacidade em profundidades variáveis medindo esferas de fluorescência.
   1. Primeiro, diluir esferas fluorescentes (ver Tabela de Materiais) com diâmetro de 0,53 μm até uma concentração de 1: 1,5 x 10⁵ usando agarose de baixa fusão a 0,8 % e transferir a solução para o tubo de FEP segmentado.
   2. Em segundo lugar, use o sistema LSM para obter imagens das contas e medir a função de dispersão pontual (FSF) em toda a amostra, validando a resolução espacial e o alinhamento do sistema¹².
      OBS: Neste sistema, a análise dos resultados representativos para a largura total na metade máxima (FWHM) indica resoluções lateral e axial de 1,26 ± 0,15 e 2,48 ± 0,15 μm (n = 60 contas), respectivamente. Isso sugere uma resolução espacial consistente em toda a profundidade da imagem.
2. Conecte o tubo FEP com larva de peixe-zebra montada firmemente ao estágio de amostra motorizado de 6 eixos (x, y, z, pitch, yaw e roll) e submerja os tubos na câmara de amostra preenchida com água E3. Para evitar o espalhamento de luz pelo saco vitelínico e localizar melhor a posição do coração, gire a larva do peixe-zebra para tirar a imagem do lado ventral (Figura 2B). Nesse caso, a maioria das imagens capturadas incluiria tanto o ventrículo quanto o átrio (Figura 2C).
   NOTA: Dado que os procedimentos de imagem atuais normalmente duraram menos de uma hora por peixe e foram realizados em um ambiente de temperatura ambiente controlada, o controle de temperatura da câmara e a regulação do nível de oxigênio são considerados opcionais para este projeto. No entanto, para estudos de imagem de lapso de tempo de longo prazo, particularmente aqueles focados em processos de desenvolvimento, sugere-se o monitoramento contínuo da temperatura e a regulação a 27 °C dentro da câmara de amostra para garantir o ambiente fisiológico do peixe-zebra e prevenir quaisquer possíveis anormalidades de desenvolvimento.
3. Conecte o estágio de amostra motorizado à estação de trabalho e configure todos os parâmetros necessários, incluindo o modo de movimentação desejado.
4. Estabeleça uma conexão entre a câmera sCMOS e a estação de trabalho. Ajuste todas as configurações essenciais, como um tempo de exposição de 5 ms e a região de interesse desejada.
5. Configure o número de sequências de imagens e quadros dentro do programa de controle LabVIEW personalizado.
6. Ligue o laser e inicie a imagem LSM da amostra. Mantenha o processo até que todas as sequências de imagens tenham sido gravadas com êxito.
7. Grave 300 quadros como uma sequência de imagens 2D para cobrir 3-5 ciclos cardíacos da larva com uma taxa de quadros de 200 quadros/segundo. O registro capta a contratilidade cardíaca no plano seletivo iluminado pela folha de luz.
8. Mova a larva no tamanho do passo de 1 μm através da iluminação da folha de luz para cortar virtualmente a amostra.
   NOTA: O tamanho do passo do estágio amostral deve ser definido com base na resolução axial do sistema de folha de luz, seguindo o teorema de amostragem de Nyquist-Shannon¹².
9. Repita a etapa 7 para gravar outra sequência de imagens da nova fatia de amostra até que todo o coração esteja coberto. Geralmente, 100-200 sequências de imagens com o tamanho do passo de 1 μm garantem a cobertura de todo o coração de uma larva de peixe-zebra (Figura 2D).
   NOTA: As etapas 4.7-4.9 são controladas pelo programa LabVIEW e executadas automaticamente pelo sistema LSM (Figura 3). Dado o grande volume de dados de imagem gerados, uma convenção de nomenclatura padronizada é recomendada para sequências de imagens. Por exemplo, designe pastas com nomes como "z-1", "z-2", etc., para categorizar dados em várias sequências de imagens. Dentro de cada sequência, as imagens devem ser nomeadas sequencialmente (por exemplo, "1", "2", ...) para denotar pontos de tempo distintos. O tempo total para montar peixes, ajustar o ângulo de imagem e coletar todos os dados para uma larva de peixe-zebra é de cerca de 1 h.

5. Reconstrução de imagem 4D com computação paralela

Horário: 1 dia
NOTA: O algoritmo de reconstrução 4D desenvolvido pelo nosso grupo e os dados da amostra são acessíveis publicamente²¹. Este método permite reconstruir a imagem do coração 4D a partir das sequências de imagens coletadas nas etapas anteriores (Tabela 1).

1. Abra o arquivo test_Parallel.m no MATLAB (consulte Tabela de Materiais). Especifique o local da pasta onde as sequências de imagens brutas são armazenadas na variável "baseDir".
2. Atribua a variável "numOfSlice" com o número total de sequências de imagens (normalmente 100-150) e a variável "numOfImage" com o número de imagens (normalmente 300-500) em cada sequência.
3. Inspecione a sequência de imagens que mostra o plano médio do coração do peixe-zebra (por exemplo, a^51ª sequência de 101 sequências totais). Identifique os números de quadro da primeira e quarta sístoles nesta sequência e atribua-os às variáveis systolicPoint_1st e systolicPoint_4th.
4. Clique em Executar para iniciar o processo.
   NOTA: A duração do ciclo cardíaco em cada sequência de imagens será primeiramente identificada pelo programa MATLAB através da comparação da similaridade (soma das diferenças quadráticas) entre as imagens em diferentes momentos. Posteriormente, o ciclo cardíaco será estimado usando a média dos comprimentos de ciclo de todas as sequências de imagens. Em seguida, os pontos de partida das sequências de imagens em diferentes localizações axiais serão alinhados pelo programa através de uma comparação iterativa da similaridade da imagem da primeira sequência de imagens para a última sequência de imagens.
5. Verifique os resultados na pasta de saída. O programa salvará as imagens como arquivos ".tif" com carimbos de data/hora. Cada arquivo ".tif" é uma imagem de coração 3D em um ponto de tempo específico. O intervalo de tempo entre duas imagens 3D é igual ao tempo de exposição definido.
   NOTA: Reconstrua as imagens adquiridas das etapas anteriores para retratar as contrações cardíacas 4D (espacial 3D + temporal 1D). Para melhorar a proficiência em investigações de alto rendimento durante a sincronização retrospectiva, essa abordagem permite operações computacionais simultâneas em uma GPU, aproveitando vários núcleos de CPU por meio da caixa de ferramentas de computação paralela MATLAB e transformando imagens no formato gpuArray.

6. 3D segmentação celular e rastreamento celular

Horário: 1 dia

1. Baixe o pacote 3DeeCellTracker (consulte Tabela de Materiais) e configure o ambiente Python²².
2. Faça o download do software de anotação ITK-SNAP²³ (consulte Tabela de Materiais) e use-o para marcar manualmente a imagem cardíaca 3D em dois momentos selecionados, um na diástole ventricular e outro na sístole ventricular, para criar os conjuntos de dados de treinamento e validação.
   NOTA: Outros softwares de rotulagem também podem ser aplicáveis.
3. Em Python, execute o programa de treinamento 3DeeCellTracker e inicialize os parâmetros noise_level(100 neste caso), folder_path e modelo na função TrainingUNet3D para definir o modelo 3D U-Net predefinido.
4. No MATLAB, use o programa imageDimConverter.m para converter e renomear o conjunto de dados de treinamento e validação para o formato adequado para carregamento.
5. Em Python, carregue os conjuntos de dados de treinamento e validação usando as funções trainer.load_dataset() e trainer.draw_dataset().
6. Em Python, execute a primeira parte do programa de rastreamento 3DeeCellTracker e inicialize os parâmetros.
   NOTA: Isso inclui a definição de parâmetros de imagem para caracterizar as dimensões da imagem, parâmetros de segmentação para selecionar o modelo de aprendizado de máquina aplicado para segmentação de células e parâmetros de rastreamento para selecionar os modelos de rede neural profunda pré-treinados empregados para o registro de células. Pela primeira vez é recomendado o uso do modelo U-Net para segmentação celular e FFN+ PR-GLS para registro celular. Ele é necessário para armazenar dados, modelo e resultados em pastas que serão criadas automaticamente nesta etapa.
7. No MATLAB, use o programa imageDimConverter.m para converter e renomear todas as imagens de coração 3D para o formato adequado e transferi-las para a pasta de dados criada na última etapa.
8. Em Python, execute a segunda parte do programa 3DeeCellTracker para iniciar a segmentação.
9. Depois que a primeira imagem 3D for segmentada, compare o resultado da segmentação com a imagem bruta e execute a correção manual se alguma segmentação incorreta for encontrada. Mova a segmentação corrigida para a pasta "/manual_vol1" criada.
10. Em Python, execute a terceira parte do programa 3DeeCellTracker para segmentar todas as imagens.
11. Use o Amira (consulte Tabela de Materiais) para realizar uma avaliação visual dos resultados do rastreamento comparando as posições das células rastreadas com suas imagens brutas correspondentes. Se os resultados do teste não forem satisfatórios, reinicie o procedimento a partir da etapa 6.6, empregue um modelo alternativo de aprendizado de máquina para segmentação ou registro de célula e, em seguida, reinicie o processo de rastreamento.
    Observação : após a segmentação, os dados de rótulos de célula são armazenados como uma imagem de 8 bits (0 a 255) por padrão, o que significa que apenas 256 escalas são fornecidas como rótulos para classificação de célula. Há duas soluções para resolver esse problema quando classes adicionais são necessárias. Uma solução é definir o formato dos dados das etiquetas das células como uma imagem de 16 bits no programa de rastreamento, o que causará um aumento exponencial no tempo de processamento, mais de dois dias no presente caso. A outra solução é usar o programa "separateTrackingResults.py" para pós-processar os rótulos das células, que separará as células com os mesmos rótulos com base em sua localização física e atribuirá a cada célula um rótulo diferente. Este processo leva cerca de 10 min neste caso.

7. Análise da contratilidade cardíaca no modo de realidade virtual

Horário: 1 dia

1. Adquira o resultado do rastreamento de células das etapas anteriores.
2. Valide manualmente os dados e selecione células com intensidade de imagem consistente em todos os volumes (cerca de 500 células de aproximadamente 600).
3. Use cellLabelsToObj.ipynb script²¹ para gerar uma malha de superfície para cada célula individual por meio do software 3D Slicer²⁴ (consulte Tabela de materiais) e atribuir um código de cores exclusivo a cada célula.
4. Exporte cada modelo 3D, consistindo de todas as células em um único ponto de tempo, como um único arquivo .obj consistindo em vários subobjetos acompanhados por um arquivo .mtl para descrever o rótulo da célula.
5. Importe os modelos para o Unity usando a licença educacional, um mecanismo de desenvolvimento usado para realidade estendida.
6. Aplique os scripts personalizados que consistem em funções escritas em C# aos modelos e elementos da interface do usuário para permitir a visualização 4D e análise interativa. Execute a interação VR seguindo a etapa 7.7.
7. Interaja com os modelos em realidade virtual (RV) utilizando as seguintes funções (Figura 4):
   1. Seleção de células: selecione até duas células por vez e visualize suas trajetórias, velocidades, volumes, áreas de superfície e distâncias relativas.
   2. Seleção do ponto de tempo: Escolha um ponto de tempo específico nos dados para analisar as saídas das células selecionadas, como em t = 0 ms durante a diástole, ou em t = 200 ms durante a sístole.
   3. Pausa de tempo: congele o modelo dinâmico para se concentrar nas células selecionadas e suas saídas.
   4. Contraste: Modula o contraste entre as células selecionadas e as células circundantes no modelo.

O protocolo atual consiste em três etapas principais: preparação e microinjeção de peixe-zebra, imagem de folha de luz e reconstrução de imagens 4D, e rastreamento celular e interação com RV. Peixes-zebra adultos foram deixados acasalar, os ovos fertilizados foram coletados e realizada microinjeção conforme necessário para os experimentos propostos (Figura 1). Esta etapa fornece um ponto de entrada para explorar as aplicações do peixe-zebra na investigação do desenvolvimento e regeneração cardíaca, e também desempenha um papel crucial nas imagens e análises subsequentes. O coração em contração foi imageado em diferentes estágios (de 3 dpf a 7 dpf) usando o sistema LSM custom-built e alinhou as sequências de imagens ao longo do eixo z para reconstruir o modelo 4D do coração do zebrafish (Figura 2 e Figura 3). Esses modelos fornecem uma base para caracterizações fenotípicas profundas e são fundamentais para revelar a dinâmica da morfologia e função cardíaca ao longo das linhas do tempo de desenvolvimento. As células individuais no coração do peixe-zebra foram rastreadas e seu movimento e interação foram quantificados usando a plataforma de RV personalizada. As mudanças de velocidade e distância relativa das células selecionadas também foram comparadas durante um ciclo cardíaco no átrio e ventrículo para avaliar a contratilidade regional e investigar o strain local (Figura 4). O strain regional foi determinado com base na variação do deslocamento entre duas células miocárdicas adjacentes na região de interesse. A fração de encurtamento (EF) e a fração de ejeção (FE) foram estimadas utilizando-se metodologias descritas na literatura25. As equações para FS e EF são as seguintes:

onde Dd e Ds são os diâmetros ventrículos (eixo curto, medido pelas distâncias entre diferentes células ventriculares) nos estágios diastólico e sistólico final, respectivamente, e Vd e Vs são os volumes ventriculares (calculados pelos diâmetros dos eixos longo e curto do ventrículo) nos estágios diastólico e sistólico final, respectivamente.

Coletivamente, esses resultados mostram uma nova estratégia que integra fisiologia e engenharia para facilitar a imagem volumétrica e a interpretação de dados em modelos de zebrafish, sendo uma grande promessa para o avanço da exploração da morfogênese e mecânica cardíaca.

Figura 1: Processo de coleta e microinjeção de ovos de peixe-zebra. O processo envolve o acasalamento de peixes-zebra adultos, a coleta de ovos fertilizados e a realização da microinjeção opcional. Durante a microinjeção, a pipeta de vidro pré-puxada é carregada com os materiais desejados. Os ovos fertilizados são alinhados em fileiras retas dentro de fendas de agarose e posicionados perpendicularmente à agulha. A microinjeção é conduzida sob observação microscópica constante dos ovos e da ponta da agulha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Processo de imagem de folha de luz e reconstrução de imagem 4D. (A) Esquema da estrutura interna do sistema de imagem de folhas de luz. CL: lente cilíndrica. EO: objetivo de excitação. OD: objetivo de detecção. TL: lente tubular. FL: filtro. CAM: câmera sCMOS. (B) Esquema de um peixe-zebra montado no tubo FEP e embutido por agarose. (C) Sequência de imagens 2D cruas capturadas de uma larva de peixe-zebra de 4 dpf. O relógio no canto superior esquerdo de cada quadro indica a fase cardíaca a partir da sístole final. (D) Ilustração da sincronização retrospectiva para registro de imagens de zebrafish 4D. A sequência de imagens indica uma gravação contínua a uma determinada profundidade ao longo do eixo z. Cada quadro na sequência de imagens é representado por um ponto vermelho, e as fases inicial e final da diástole final para a sístole final são destacadas na caixa amarela. (E) Modelos cardíacos reconstruídos em 4D a partir das sequências de imagens 2D. Dpf: dias pós-fertilização. Esse número é adaptado de Zhang et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Painel de controle do LabVIEW. (A) As configurações usadas no painel de controle englobam a configuração do laser, da câmera, do caminho da imagem e do padrão do motor. (B) Um exemplo de uma imagem crua do coração do peixe-zebra capturada pelo programa LabVIEW. Barra de escala: 30 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: O rastreamento celular e a interação com RV auxiliam na revelação da contratilidade cardíaca do peixe-zebra. (A) Células rastreadas do coração de peixe-zebra Tg(myl7:nucGFP) a 3 dpf. (B) A plataforma VR fornece aos usuários uma visualização imersiva e experiência interativa de um modelo de coração de peixe-zebra 4D, permitindo visualizar a função cardíaca ao longo do tempo por meio de análise definida pelo usuário. (C) Após a coleta das medidas da plataforma de RV, as mudanças de velocidade e distância relativa foram comparadas durante um ciclo cardíaco entre células selecionadas a 3 dpf e 7 dpf. As duas primeiras figuras apresentam as mudanças de velocidade média em cinco células ventriculares e cinco células atriais, e as demais ilustram as mudanças na distância relativa entre três grupos de células, ou seja, duas células ventriculares, uma célula ventricular e uma célula atrial e duas células atriais. (D) Avaliação da função cardíaca de corações de 3 dpf e 7 dpf de zebrafish. Um total de 370 células foram rastreadas em corações de peixe-zebra a 3 dpf, e 580 células foram rastreadas a 7 dpf. Esse número é adaptado de Zhang et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Tabela de recursos personalizados. Os códigos de exemplo e os dados são carregados no Zenodo21.

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.