Este artigo apresenta uma técnica única de tórax fechado para induzir lesão de isquemia-reperfusão miocárdica (IRI) em camundongos. O método apresentado permite que os camundongos respirem espontaneamente enquanto induzem remotamente a isquemia miocárdica. Isso fornece acesso ao animal para estudar os processos dinâmicos de isquemia e reperfusão in situ e em tempo real por meio de imagens não invasivas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Oclusão LAD acionada remotamente usando um cateter de balão em camundongos que respiram espontaneamente
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O infarto agudo do miocárdio (IAM) é uma condição cardiovascular prevalente e de alta mortalidade. Apesar dos avanços nas estratégias de revascularização do IAM, ele frequentemente leva à lesão miocárdica de isquemia-reperfusão (IRI), amplificando o dano cardíaco. Os modelos murinos servem como ferramentas vitais para investigar tanto a lesão aguda quanto o remodelamento crônico do miocárdio in vivo. Este estudo apresenta uma técnica única de tórax fechado para induzir remotamente a IRI miocárdica em camundongos, permitindo a investigação da fase inicial de oclusão e reperfusão usando imagens in vivo, como ressonância magnética ou PET. O protocolo utiliza um método de oclusão remota, permitindo um controle preciso sobre o início da isquemia após o fechamento torácico. Reduz o trauma cirúrgico, permite a respiração espontânea e melhora a consistência experimental. O que diferencia essa técnica é seu potencial para imagens não invasivas simultâneas, incluindo ultrassom e ressonância magnética (RM), durante eventos de oclusão e reperfusão. Ele oferece uma oportunidade única de analisar as respostas teciduais quase em tempo real, fornecendo informações críticas sobre os processos durante a isquemia e a reperfusão. Testes sistemáticos extensivos dessa abordagem inovadora foram realizados, medindo marcadores de necrose cardíaca para infarto, avaliando a área de risco usando ressonância magnética com contraste e colorindo infartos no estágio de maturação da cicatriz. Por meio dessas investigações, a ênfase foi colocada no valor da ferramenta proposta no avanço das abordagens de pesquisa para a lesão de isquemia-reperfusão miocárdica e na aceleração do desenvolvimento de intervenções direcionadas. Os resultados preliminares que demonstram a viabilidade de combinar o protocolo experimental inovador proposto com técnicas de imagem não invasivas são apresentados aqui. Esses resultados iniciais destacam o benefício de utilizar o berço animal construído especificamente para induzir remotamente isquemia miocárdica enquanto realiza exames de ressonância magnética.
Introdução
O infarto agudo do miocárdio (IAM), uma condição cardiovascular global prevalente, está associado a altas taxas de mortalidade e morbidade1. Apesar dos avanços tecnológicos que possibilitaram estratégias de revascularização precoces e eficazes para pacientes com IAM, os pacientes ainda apresentam lesão de isquemia-reperfusão miocárdica (IRI) após essas intervenções2. Portanto, entender os mecanismos fundamentais e formular abordagens para mitigar o IRI é crucial. O IRI representa um estado fisiopatológico complexo que envolve uma infinidade de processos biológicos intrincados. Estes abrangem morte celular regulada, respostas ao estresse oxidativo, inflamação, cicatrização de feridas, fibrose e remodelação ventricular. Modelos animais, como camundongos, têm sido de grande importância para a pesquisa do IRI e são amplamente empregados devido à sua relação custo-benefício, reprodução rápida e riqueza de informações mecanicistas de modelos transgênicos3.
Este protocolo apresenta uma técnica inovadora para induzir remotamente a IRI em camundongos que respiram espontaneamente com o tórax fechado, imitando mais de perto a patologia humana. A oclusão remota foi obtida utilizando-se um cateter-balão posicionado a uma distância do miocárdio para ocluir a artéria descendente anterior (DAE). Essa abordagem oferece acesso contínuo ao coração batendo nos momentos exatos de oclusão e reperfusão, facilitando modalidades de imagem simultâneas, incluindo ultrassom ou ressonância magnética (RM). Esses métodos não invasivos podem fornecer informações cruciais sobre as respostas teciduais antes, durante e após eventos de oclusão e reperfusão.
Existem várias técnicas cirúrgicas para induzir IRI em modelos murinos. O trauma cirúrgico decorrente da toracotomia em modelos de ligadura coronariana de tórax aberto desencadeia uma resposta imune impactando diversos mecanismos associados à isquemia e reperfusão. A ativação do sistema imune inato tem o potencial de influenciar a extensão do infarto do miocárdio4. A técnica adaptada proposta fornece uma abordagem potencial para explorar o pré e pós-condicionamento miocárdico e possivelmente reduzir o impacto da resposta imune inata ao trauma cirúrgico em estudos de IRI murino, minimizando o período de tempo de tórax aberto para um máximo de 5 min. Além disso, a técnica recém-desenvolvida também pode contribuir para reduzir as sequelas pró-inflamatórias causadas pela lesão pulmonar induzida pela ventilação mecânica5. No entanto, os efeitos combinados desse novo método de tórax fechado exigiriam uma investigação mais aprofundada.
A validação minuciosa da técnica proposta foi realizada comparando-a com o método tradicional, que envolve a exposição da DA por meio de dissecção cirúrgica do tórax e oclusão induzida por ligadura por 30 min. Os resultados de ambas as técnicas foram comparados, incluindo medições de troponina refletindo o tamanho do infarto cardíaco, avaliações da área de risco usando ressonância magnética com realce pelo contraste de gadolínio, coloração histológica de cloreto de trifenil tetrazólio (TTC) e a determinação dos tamanhos finais da cicatriz por meio da coloração Sirius Red (SR). O resultado demonstra a robustez e eficácia da abordagem proposta para o estudo da lesão de isquemia-reperfusão em modelos murinos.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Este protocolo animal foi aprovado e está de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Comitê de Ética para Experimentação Animal (ECD) da Universidade Católica de Leuven. Todas as políticas desenvolvidas pelo ECD local seguem os regulamentos da União Europeia relativos ao bem-estar dos animais de laboratório, conforme declarado na Diretiva 2010/63/UE. Todos os testes descritos abaixo foram realizados em camundongos C57BL/6 machos de 8-12 semanas (peso corporal = 20-23 g) de 6 semanas. Os experimentos agudos representam animais que foram imediatamente sacrificados após a cirurgia. Os experimentos de sobrevivência representaram um acompanhamento de quatro semanas, incluindo medição de troponina, ressonância magnética e coloração SR.
1. Anestesia e intubação endotraqueal
- Administrar medicação pré-anestésica usando uma mistura de cetamina (7,5 mg/kg; Nimatek 100 mg/mL), xilazina (1 mg/kg; Rompun, 20 mg/mL) e acepromazina (0,1 mg/kg; Placivet, 10 mg/ml) (KXA) (ver Tabela de Materiais) com diluente salino a 0,9% por via intraperitoneal. Isso permite uma intubação mais suave e menos invasiva.
- Coloque o mouse em uma câmara de indução (consulte a Tabela de Materiais) e invoque a anestesia usando isoflurano a 2,5% em oxigênio puro com uma taxa de fluxo de 1 L / min até a perda do endireitamento e do reflexo de pinça do dedo do pé.
- Transfira o animal para uma almofada aquecida (±38 °C) e posicione-o em decúbito dorsal com a cabeça voltada para o cirurgião. Fixe a cauda e as patas dianteiras com fita adesiva na almofada. Certifique-se de que os membros dianteiros não estejam sobrecarregados, pois isso pode comprometer a respiração.
- Coloque uma sutura de seda 2-0 (consulte a Tabela de Materiais) ao redor dos incisivos superiores e prenda a sutura na borda da almofada para esticar o mouse. Se necessário, coloque um porta-agulha para manter a tensão na sutura. Manter o animal anestesiado com isoflurano a 2% em oxigênio a 100% com fluxo de 1 L/min usando um cone nasal.
- Coloque uma fonte de luz logo rostral do esterno, remova o cone do nariz e coloque o suprimento de isoflurano no ventilador. Intubar o mouse usando uma pinça, levantando a língua para cima e segurando um laringoscópio de fabricação própria para levantar ainda mais a parte basal da língua e visualizar as cordas vocais.
- Coloque um tubo traqueal feito por você mesmo usando um cateter 18 G em uma agulha cega entre as cordas vocais. Suba o cateter, extraia a agulha cega e conecte o tubo ao ventilador do mouse (consulte a Tabela de Materiais).
- Use um conector em forma de Y modificado (consulte a Tabela de Materiais) para conectar o tubo de intubação ao ventilador. O posicionamento correto do tubo traqueal pode ser confirmado pelo julgamento da expansão torácica simétrica.
- Defina o volume corrente (mL) no peso corporal (PC) (g) x 7 e a taxa de ventilação em 53,5 x (PC (g) -0,26) golpes por minuto e ajuste-o ao peso corporal de um camundongo específico, se necessário6 (por exemplo, para um camundongo de 25 g, o volume corrente é de 175 mL a 140 golpes por minuto).
- Reduza o isoflurano para 1% em oxigênio a 100%, pois o animal ficará anestesiado devido à pré-medicação. No entanto, avalie regularmente a profundidade da anestesia realizando uma pinça no dedo do pé. Adapte a concentração de isoflurano com base na profundidade da anestesia.
- Aplique uma gota de pomada oftálmica para evitar o ressecamento durante a anestesia.
2. Instalação da ferramenta IRI
NOTA: Remova todas as fitas e coloque o animal na placa de base da ferramenta IRI criada para esse fim. Detalhes sobre as propriedades da ferramenta IRI são mencionados no Arquivo Suplementar 1.
- Fixe a placa de base da ferramenta IRI remota construída especificamente em uma posição lateral na frente do cirurgião. Fixe a cauda e as patas usando fita adesiva. Fixe a cabeça usando a sutura de seda 2-0 ao redor dos incisivos superiores para evitar movimentos acidentais (Figura 1).
- Insira a sonda térmica retal (consulte a Tabela de Materiais) para monitorar a temperatura corporal e use uma lâmpada de aquecimento infravermelho acima do animal para manter a temperatura em torno de 37 ° C. Preste atenção à distância suficiente entre o animal e a lâmpada para evitar superaquecimento.
- Posicione os eletrodos de agulha de ECG em todas as quatro patas para observar e registrar a frequência cardíaca e a forma de onda do ECG. Prenda a sonda retal e os eletrodos de ECG à plataforma usando fita adesiva.
- Aplique o creme depilatório no lado esquerdo do tórax para remover os pelos e criar um campo cirúrgico claro.
NOTA: Limite o tempo de aplicação e preste atenção à remoção completa do creme para evitar queimaduras químicas.
3. Toracotomia
- Realize a preparação asséptica da pele usando a solução de Betadina e, em seguida, coloque uma cortina cirúrgica no tórax esquerdo para garantir um ambiente estéril. Use equipamento esterilizado para realizar o procedimento. Faça uma incisão vertical na pele na porção média do músculo peitoral com aproximadamente 1 cm de comprimento e 2 mm de distância da borda esternal esquerda.
- Cuspa o músculo peitoral para expor as costelas por baixo. Evite ferimentos acidentais no vaso. Se ocorrer sangramento, use aplicadores de algodão para estancar qualquer sangramento.
- Visualize as costelas e identifique os espaços intercostais observando o pulmão inflado através da parede torácica fina e semitransparente. Abra a cavidade torácica usando uma tesoura cirúrgica fazendo uma incisão de 6-8 mm no terceiro espaço intercostal. Certifique-se de que a incisão esteja a no mínimo 2 mm da borda esternal onde a artéria torácica interna está localizada.
- Insira um pequeno espéculo olho de rato (consulte a Tabela de Materiais) no espaço intercostal. Isso funcionará como um retrator de costela (Figura 1A).
- Levante suavemente o pericárdio com uma pinça curva e separe-o.
- Coloque um pequeno pedaço de algodão em cima do pulmão e empurre suavemente para baixo.
4. Preparação do LAD
- A DA aparece em vermelho brilhante e vai da aorta sob a aurícula esquerda em direção ao ápice. O posicionamento ideal para a ligadura é aproximadamente 2 mm mais baixo que a ponta da aurícula esquerda. Use o tronco pulmonar como marcador para ajudar a identificar a aurícula esquerda e otimizar a visualização da DA usando influxo de luz (Figura 2).
- Use uma agulha cônica para passar uma sutura de polipropileno 7-0 ao redor do LAD. Não coloque a agulha muito fundo, pois ela pode entrar no ventrículo esquerdo, nem muito rasa, pois pode danificar o LAD.
- Remova o pequeno pedaço de algodão e verifique se o pulmão esquerdo ainda está ventilado.
- Remova o retrator de costelas.
- Certifique-se de que a sutura tenha um comprimento mínimo de 15 cm em ambas as extremidades. Corte a agulha.
- Coloque um pedaço de tubo PE-1 de 50 mm sobre um pedaço de tubo PE-10 de 15 mm (consulte a Tabela de Materiais). Guie ambas as extremidades da sutura através do tubo PE-10 e desloque o tubo PE com sua extremidade mais grossa contra o coração.
5. Fechamento do tórax e extubação
- Aplique um pouco de gel de ácido fusídico no espaço intercostal aberto e deixe escapar suavemente o ar intratorácico restante, obstruindo brevemente a saída do ventilador. Gel de ácido fusídico adicional pode ser adicionado à parte externa do tubo de PE para evitar a entrada de ar no tórax.
- Feche o músculo peitoral com um ponto X de polipropileno 5-0 acima e abaixo do nível do tubo PE e certifique-se de que a parte espessada do tubo PE esteja abaixo do nível do músculo.
- Feche a pele com dois pontos em X de polipropileno 5-0 acima e dois abaixo do tubo de PE (Figura 1B e Figura 3).
- Com o peito fechado, o animal pode respirar espontaneamente novamente. Desmame o animal do ventilador, reduzindo lentamente o volume corrente e a frequência respiratória. Quando o animal começar a respirar, desconecte espontaneamente o tubo do ventilador, mas mantenha-o no lugar até que um padrão respiratório estável seja observado.
- Conecte o suprimento de isoflurano com um nariz que é colocado sobre o nariz do animal e fixado na placa de base.
6. Montagem da ferramenta IR remota
- Coloque a parte lateral vertical na placa de base, inserindo-a nas fendas.
- Use um gancho fino para recuperar as duas extremidades da sutura e puxe-as pelo orifício central na parte lateral atrás do balão (consulte a Tabela de Materiais).
- Guie uma das extremidades das suturas acima e ao redor do balão. Siga com a outra extremidade da sutura sob e ao redor do balão. Aplique gel de ácido fusídico para uma orientação mais suave da sutura.
- Guie as extremidades da sutura pelas fendas na parte superior da parte lateral. Na parte distal da sutura, aplique um peso de 2,1 g para manter cada extremidade da sutura no lugar (Figura 1C e Figura 4).
NOTA: A configuração dos pesos apropriados está sujeita a alterações e deve ser testada previamente. Consulte a Figura Suplementar 1 e o Arquivo Suplementar 1 para obter detalhes. O design da ferramenta IRI remota é fornecido na Figura Suplementar 2.
7. Indução de isquemia e reperfusão
- Induza a isquemia inflando imediatamente o balão usando a bomba de balão vascular até 2 bar. Bloqueie a bomba. Verifique visualmente se o balão está inflado e os pesos estão levantados (Figura 4).
- Confirme a isquemia observando a alteração no traço do ECG.
- Deixe o balão inflado pelo tempo definido de acordo com o protocolo específico do estudo (30 min nos experimentos apresentados).
- Pare a oclusão simplesmente destravando a bomba. Esvazie o balão com cuidado. Verifique visualmente se o balão está vazio e os pesos estão abaixados.
8. Desmontagem da ferramenta IR remota
- Corte a sutura e o tubo entre o animal e a parte lateral e remova cuidadosamente a parte lateral.
- Aplique gel de ácido fusídico no local de inserção do tubo no tórax. Use uma pinça curva para empurrar suavemente a pele contra o tubo e use outra pinça para extrair o tubo. Corte qualquer sutura restante perto da pele.
- Coloque uma sutura extra de polipropileno 5-0 para fechar o local de saída do tubo e minimizar o risco de entrada de ar no tórax.
9. Fim da narcose e recuperação
- Pare o suprimento de isoflurano e permita que o animal acorde em um ambiente silencioso, quente e rico em oxigênio.
- Confirme se o camundongo não está com nenhum desconforto respiratório, observando-o até a recuperação total. Forneça 0,3 mL de solução salina estéril (à temperatura corporal) por injeção intraperitoneal para evitar a desidratação.
- Para analgesia pós-operatória, administre um analgésico opioide (buprenorfina, 0,1 mg / kg) por via subcutânea antes que o animal seja deambulatório. Verifique os camundongos a cada 4-6 h pelas próximas 24-48 h quando a buprenorfina for fornecida para garantir que os camundongos estejam respondendo aos analgésicos e para determinar se são necessários analgésicos adicionais. O suporte adicional deve incluir um gel ou purê de dieta de cuidados de suporte padrão recomendado colocado no chão da gaiola no pós-operatório.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A validação da capacidade de induzir isquemia foi realizada por quatro testes: coloração com cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) e Sirius Red (SR), dosagem de troponina I cardíaca e ressonância magnética com realce tardio com gadolínio (LGE). A significância estatística foi avaliada por meio do teste não paramétrico de Mann-Whitney, considerando os tamanhos amostrais limitados. A significância estatística foi atribuída a p < 0,05.
Os experimentos agudos (coloração TTC, n = 15) não ...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
A nova técnica de oclusão remota introduzida neste estudo oferece uma plataforma única para avançar na pesquisa no campo da modelagem de lesões de isquemia-reperfusão, evitando a necessidade de manipulação direta do vaso durante a cirurgia inicial e permitindo imagens multimodais simultâneas do miocárdio reperfundido precocemente. A caracterização abrangente, incluindo medições de troponina-I, ressonância magnética com contraste LGE, TTC e coloração SR, mostra que a técnica proposta é eq...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm conflito de interesses a divulgar.
Agradecimentos
Os experimentos foram realizados na instalação central da KU Leuven 'Molecular Small Animal Imaging Center' (MoSAIC). Os autores gostariam de expressar seus agradecimentos a Katarzyna Błażejczyk pela assistência técnica. A pesquisa foi financiada por bolsas de pesquisa da KU Leuven (C14/20/095) e da Fundação de Pesquisa - Flandres (FWO G0A7722N). M. Algoet é apoiado pela Research Foundation - Flanders Fellowship Grant (FWO 11A2423N).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sutura de seda 2-0 | Sharpoint Products | DC-2515N | |
| 5-0 sutura de polipropileno | Ethicon | 8710H | |
| 7-0 sutura de polipropileno | Ethicon | 8206H | |
| ACCLARENT Dispositivo de inflação de balão | Johnson& Johnson MedTech | BID30 | |
| Acepromazina | Kela | ||
| BD Vialon 18 G | BD | 381347 | |
| BD Vialon 20 G | BD | 381334 | |
| Solução Betadine | Purdue Pharma | 25655-41-8 | |
| Buprenorfina (Buprenex Injetável) | Reckitt Benkiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | |
| Carpa Zoom Styl Knijplood 2,1 g (pesos de pesca de chumbo) | Visdeal.nl | ||
| Dumont # 3 Fórceps | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont # 5 Fórceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Tesoura Fina | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Fucidine gel | Leo Pharma | ||
| Isoflurane | Abbott | NDC 5260-04-05 | |
| KD Espéculo de Olho de Camundongo/Rato | World Precision Instruments | 501897 | |
| Espéculo de olho de rato/rato KD | Precision Instruments | 501897 | |
| Ketamine | Dechra | ||
| Fonte de luz | Zeiss | KL 1500 | |
| Bruker BioSpin, Ettlingen, Alemanha | BioSpec 70/30 | ||
| NatriumChloride 0,9% | Baxter | ||
| Lâmpada de calor infravermelho noturno | Zoo Med Laboratories, Inc. | RS-75 | |
| ParaVision | Bruker BioSpin | versão 6.0.1 | |
| tubo de polietileno PE-10 | SAI Tecnologias de infusão | PE-10 | |
| tubo de polietileno PE-50 | SAI Tecnologias de infusão | PE-50 | |
| ferramenta IRI remota (PMMA) | monitor cirúrgico de | ||
| Instrumentos | Indus | ||
| Segmento v4.0 | Medviso, segment.heiberg.se | R12067 | |
| Sequência de eco gradiente auto-fechada | Bruker BioSpin, Ettlingen, Alemanha | IntraGate, ParaVision 6.0.1 | |
| Suporte de Agulha Alongado Fino | Science Tools | 12005-15 | |
| Câmara de Indução de Mouse/Rato Sure-Seal Conectores | de Tubulação EZ-178 | da World Precision Instruments | |
| , Poli, Forma Y | Westlab | 072025-0001 | |
| Cateter de dilatação Ultraverse 035 PTA: balão RBP de 5 mm x 40 mm, 17 ATM em cateter de 130 cm de comprimento | Bard Peripheral Vascular, Inc. | ||
| Veet (creme depilatório) | Reckitt Benkiser Healthcare | ||
| Ventilator, MiniVent Modelo 845 | Hugo Sachs | 73-0043 | |
| Vidisic | BAUSCH & LOMB PHARMA | 685313 | |
| Xylazine | Bayer |
Referências
- Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
- Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. Am Heart J. 101 (5), 593-600 (1981).
- Ibáñez, B., et al. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. J Am Coll Cardiol. 65 (14), 1454-1471 (2015).
- Dąbrowska, A. M., et al. The immune response to surgery and infection. Cent Eur J Immunol. 39 (4), 532-537 (2014).
- Muthuramu, I., et al. Permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice: a model of post-myocardial infarction remodelling and heart failure. J Vis Exp. (94), e52206(2014).
- Nickles, H. T., et al. Mechanical ventilation causes airway distension with proinflammatory sequelae in mice. Am J Physiol-Lung C. 307 (1), L27-L37 (2014).
- Reed, G. W., et al. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).
- Rittié, L. Method for picrosirius red-polarization detection of collagen fibers in tissue sections. Methods Mol Biol. 1627, 395-407 (2017).
- Schwarte, L. A., et al. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
- Vaneker, M., et al. Mechanical ventilation induces a Toll/Interleukin-1 receptor domain-containing adapter-inducing interferon β-dependent inflammatory response in healthy mice. Anesthesiology. 111, 836-843 (2009).
- Van Allen, N. R., et al. The role of volatile anesthetics in cardioprotection: A systematic review. Med Gas Res. 2, 22(2012).
- Kumar, D., et al. Distinct mouse coronary anatomy and myocardial infarction consequent to ligation. Coron Artery Dis. 16 (1), 41-44 (2005).
- Bayat, H., et al. Progressive heart failure after myocardial infarction in mice. Basic Res Cardiol. 97 (3), 206-213 (2002).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
