Oclusão LAD acionada remotamente usando um cateter de balão em camundongos que respiram espontaneamente

Resumo

Este artigo apresenta uma técnica única de tórax fechado para induzir lesão de isquemia-reperfusão miocárdica (IRI) em camundongos. O método apresentado permite que os camundongos respirem espontaneamente enquanto induzem remotamente a isquemia miocárdica. Isso fornece acesso ao animal para estudar os processos dinâmicos de isquemia e reperfusão in situ e em tempo real por meio de imagens não invasivas.

Resumo

O infarto agudo do miocárdio (IAM) é uma condição cardiovascular prevalente e de alta mortalidade. Apesar dos avanços nas estratégias de revascularização do IAM, ele frequentemente leva à lesão miocárdica de isquemia-reperfusão (IRI), amplificando o dano cardíaco. Os modelos murinos servem como ferramentas vitais para investigar tanto a lesão aguda quanto o remodelamento crônico do miocárdio in vivo. Este estudo apresenta uma técnica única de tórax fechado para induzir remotamente a IRI miocárdica em camundongos, permitindo a investigação da fase inicial de oclusão e reperfusão usando imagens in vivo, como ressonância magnética ou PET. O protocolo utiliza um método de oclusão remota, permitindo um controle preciso sobre o início da isquemia após o fechamento torácico. Reduz o trauma cirúrgico, permite a respiração espontânea e melhora a consistência experimental. O que diferencia essa técnica é seu potencial para imagens não invasivas simultâneas, incluindo ultrassom e ressonância magnética (RM), durante eventos de oclusão e reperfusão. Ele oferece uma oportunidade única de analisar as respostas teciduais quase em tempo real, fornecendo informações críticas sobre os processos durante a isquemia e a reperfusão. Testes sistemáticos extensivos dessa abordagem inovadora foram realizados, medindo marcadores de necrose cardíaca para infarto, avaliando a área de risco usando ressonância magnética com contraste e colorindo infartos no estágio de maturação da cicatriz. Por meio dessas investigações, a ênfase foi colocada no valor da ferramenta proposta no avanço das abordagens de pesquisa para a lesão de isquemia-reperfusão miocárdica e na aceleração do desenvolvimento de intervenções direcionadas. Os resultados preliminares que demonstram a viabilidade de combinar o protocolo experimental inovador proposto com técnicas de imagem não invasivas são apresentados aqui. Esses resultados iniciais destacam o benefício de utilizar o berço animal construído especificamente para induzir remotamente isquemia miocárdica enquanto realiza exames de ressonância magnética.

Introdução

O infarto agudo do miocárdio (IAM), uma condição cardiovascular global prevalente, está associado a altas taxas de mortalidade e morbidade¹. Apesar dos avanços tecnológicos que possibilitaram estratégias de revascularização precoces e eficazes para pacientes com IAM, os pacientes ainda apresentam lesão de isquemia-reperfusão miocárdica (IRI) após essas intervenções². Portanto, entender os mecanismos fundamentais e formular abordagens para mitigar o IRI é crucial. O IRI representa um estado fisiopatológico complexo que envolve uma infinidade de processos biológicos intrincados. Estes abrangem morte celular regulada, respostas ao estresse oxidativo, inflamação, cicatrização de feridas, fibrose e remodelação ventricular. Modelos animais, como camundongos, têm sido de grande importância para a pesquisa do IRI e são amplamente empregados devido à sua relação custo-benefício, reprodução rápida e riqueza de informações mecanicistas de modelos transgênicos³.

Este protocolo apresenta uma técnica inovadora para induzir remotamente a IRI em camundongos que respiram espontaneamente com o tórax fechado, imitando mais de perto a patologia humana. A oclusão remota foi obtida utilizando-se um cateter-balão posicionado a uma distância do miocárdio para ocluir a artéria descendente anterior (DAE). Essa abordagem oferece acesso contínuo ao coração batendo nos momentos exatos de oclusão e reperfusão, facilitando modalidades de imagem simultâneas, incluindo ultrassom ou ressonância magnética (RM). Esses métodos não invasivos podem fornecer informações cruciais sobre as respostas teciduais antes, durante e após eventos de oclusão e reperfusão.

Existem várias técnicas cirúrgicas para induzir IRI em modelos murinos. O trauma cirúrgico decorrente da toracotomia em modelos de ligadura coronariana de tórax aberto desencadeia uma resposta imune impactando diversos mecanismos associados à isquemia e reperfusão. A ativação do sistema imune inato tem o potencial de influenciar a extensão do infarto do miocárdio⁴. A técnica adaptada proposta fornece uma abordagem potencial para explorar o pré e pós-condicionamento miocárdico e possivelmente reduzir o impacto da resposta imune inata ao trauma cirúrgico em estudos de IRI murino, minimizando o período de tempo de tórax aberto para um máximo de 5 min. Além disso, a técnica recém-desenvolvida também pode contribuir para reduzir as sequelas pró-inflamatórias causadas pela lesão pulmonar induzida pela ventilação mecânica⁵. No entanto, os efeitos combinados desse novo método de tórax fechado exigiriam uma investigação mais aprofundada.

A validação minuciosa da técnica proposta foi realizada comparando-a com o método tradicional, que envolve a exposição da DA por meio de dissecção cirúrgica do tórax e oclusão induzida por ligadura por 30 min. Os resultados de ambas as técnicas foram comparados, incluindo medições de troponina refletindo o tamanho do infarto cardíaco, avaliações da área de risco usando ressonância magnética com realce pelo contraste de gadolínio, coloração histológica de cloreto de trifenil tetrazólio (TTC) e a determinação dos tamanhos finais da cicatriz por meio da coloração Sirius Red (SR). O resultado demonstra a robustez e eficácia da abordagem proposta para o estudo da lesão de isquemia-reperfusão em modelos murinos.

Protocolo

Este protocolo animal foi aprovado e está de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Comitê de Ética para Experimentação Animal (ECD) da Universidade Católica de Leuven. Todas as políticas desenvolvidas pelo ECD local seguem os regulamentos da União Europeia relativos ao bem-estar dos animais de laboratório, conforme declarado na Diretiva 2010/63/UE. Todos os testes descritos abaixo foram realizados em camundongos C57BL/6 machos de 8-12 semanas (peso corporal = 20-23 g) de 6 semanas. Os experimentos agudos representam animais que foram imediatamente sacrificados após a cirurgia. Os experimentos de sobrevivência representaram um acompanhamento de quatro semanas, incluindo medição de troponina, ressonância magnética e coloração SR.

1. Anestesia e intubação endotraqueal

1. Administrar medicação pré-anestésica usando uma mistura de cetamina (7,5 mg/kg; Nimatek 100 mg/mL), xilazina (1 mg/kg; Rompun, 20 mg/mL) e acepromazina (0,1 mg/kg; Placivet, 10 mg/ml) (KXA) (ver Tabela de Materiais) com diluente salino a 0,9% por via intraperitoneal. Isso permite uma intubação mais suave e menos invasiva.
2. Coloque o mouse em uma câmara de indução (consulte a Tabela de Materiais) e invoque a anestesia usando isoflurano a 2,5% em oxigênio puro com uma taxa de fluxo de 1 L / min até a perda do endireitamento e do reflexo de pinça do dedo do pé.
3. Transfira o animal para uma almofada aquecida (±38 °C) e posicione-o em decúbito dorsal com a cabeça voltada para o cirurgião. Fixe a cauda e as patas dianteiras com fita adesiva na almofada. Certifique-se de que os membros dianteiros não estejam sobrecarregados, pois isso pode comprometer a respiração.
4. Coloque uma sutura de seda 2-0 (consulte a Tabela de Materiais) ao redor dos incisivos superiores e prenda a sutura na borda da almofada para esticar o mouse. Se necessário, coloque um porta-agulha para manter a tensão na sutura. Manter o animal anestesiado com isoflurano a 2% em oxigênio a 100% com fluxo de 1 L/min usando um cone nasal.
5. Coloque uma fonte de luz logo rostral do esterno, remova o cone do nariz e coloque o suprimento de isoflurano no ventilador. Intubar o mouse usando uma pinça, levantando a língua para cima e segurando um laringoscópio de fabricação própria para levantar ainda mais a parte basal da língua e visualizar as cordas vocais.
6. Coloque um tubo traqueal feito por você mesmo usando um cateter 18 G em uma agulha cega entre as cordas vocais. Suba o cateter, extraia a agulha cega e conecte o tubo ao ventilador do mouse (consulte a Tabela de Materiais).
7. Use um conector em forma de Y modificado (consulte a Tabela de Materiais) para conectar o tubo de intubação ao ventilador. O posicionamento correto do tubo traqueal pode ser confirmado pelo julgamento da expansão torácica simétrica.
8. Defina o volume corrente (mL) no peso corporal (PC) (g) x 7 e a taxa de ventilação em 53,5 x (PC (g) ^-0,26) golpes por minuto e ajuste-o ao peso corporal de um camundongo específico, se necessário⁶ (por exemplo, para um camundongo de 25 g, o volume corrente é de 175 mL a 140 golpes por minuto).
9. Reduza o isoflurano para 1% em oxigênio a 100%, pois o animal ficará anestesiado devido à pré-medicação. No entanto, avalie regularmente a profundidade da anestesia realizando uma pinça no dedo do pé. Adapte a concentração de isoflurano com base na profundidade da anestesia.
10. Aplique uma gota de pomada oftálmica para evitar o ressecamento durante a anestesia.

2. Instalação da ferramenta IRI

NOTA: Remova todas as fitas e coloque o animal na placa de base da ferramenta IRI criada para esse fim. Detalhes sobre as propriedades da ferramenta IRI são mencionados no Arquivo Suplementar 1.

1. Fixe a placa de base da ferramenta IRI remota construída especificamente em uma posição lateral na frente do cirurgião. Fixe a cauda e as patas usando fita adesiva. Fixe a cabeça usando a sutura de seda 2-0 ao redor dos incisivos superiores para evitar movimentos acidentais (Figura 1).
2. Insira a sonda térmica retal (consulte a Tabela de Materiais) para monitorar a temperatura corporal e use uma lâmpada de aquecimento infravermelho acima do animal para manter a temperatura em torno de 37 ° C. Preste atenção à distância suficiente entre o animal e a lâmpada para evitar superaquecimento.
3. Posicione os eletrodos de agulha de ECG em todas as quatro patas para observar e registrar a frequência cardíaca e a forma de onda do ECG. Prenda a sonda retal e os eletrodos de ECG à plataforma usando fita adesiva.
4. Aplique o creme depilatório no lado esquerdo do tórax para remover os pelos e criar um campo cirúrgico claro.
   NOTA: Limite o tempo de aplicação e preste atenção à remoção completa do creme para evitar queimaduras químicas.

3. Toracotomia

1. Realize a preparação asséptica da pele usando a solução de Betadina e, em seguida, coloque uma cortina cirúrgica no tórax esquerdo para garantir um ambiente estéril. Use equipamento esterilizado para realizar o procedimento. Faça uma incisão vertical na pele na porção média do músculo peitoral com aproximadamente 1 cm de comprimento e 2 mm de distância da borda esternal esquerda.
2. Cuspa o músculo peitoral para expor as costelas por baixo. Evite ferimentos acidentais no vaso. Se ocorrer sangramento, use aplicadores de algodão para estancar qualquer sangramento.
3. Visualize as costelas e identifique os espaços intercostais observando o pulmão inflado através da parede torácica fina e semitransparente. Abra a cavidade torácica usando uma tesoura cirúrgica fazendo uma incisão de 6-8 mm no terceiro espaço intercostal. Certifique-se de que a incisão esteja a no mínimo 2 mm da borda esternal onde a artéria torácica interna está localizada.
4. Insira um pequeno espéculo olho de rato (consulte a Tabela de Materiais) no espaço intercostal. Isso funcionará como um retrator de costela (Figura 1A).
5. Levante suavemente o pericárdio com uma pinça curva e separe-o.
6. Coloque um pequeno pedaço de algodão em cima do pulmão e empurre suavemente para baixo.

4. Preparação do LAD

1. A DA aparece em vermelho brilhante e vai da aorta sob a aurícula esquerda em direção ao ápice. O posicionamento ideal para a ligadura é aproximadamente 2 mm mais baixo que a ponta da aurícula esquerda. Use o tronco pulmonar como marcador para ajudar a identificar a aurícula esquerda e otimizar a visualização da DA usando influxo de luz (Figura 2).
2. Use uma agulha cônica para passar uma sutura de polipropileno 7-0 ao redor do LAD. Não coloque a agulha muito fundo, pois ela pode entrar no ventrículo esquerdo, nem muito rasa, pois pode danificar o LAD.
3. Remova o pequeno pedaço de algodão e verifique se o pulmão esquerdo ainda está ventilado.
4. Remova o retrator de costelas.
5. Certifique-se de que a sutura tenha um comprimento mínimo de 15 cm em ambas as extremidades. Corte a agulha.
6. Coloque um pedaço de tubo PE-1 de 50 mm sobre um pedaço de tubo PE-10 de 15 mm (consulte a Tabela de Materiais). Guie ambas as extremidades da sutura através do tubo PE-10 e desloque o tubo PE com sua extremidade mais grossa contra o coração.

5. Fechamento do tórax e extubação

1. Aplique um pouco de gel de ácido fusídico no espaço intercostal aberto e deixe escapar suavemente o ar intratorácico restante, obstruindo brevemente a saída do ventilador. Gel de ácido fusídico adicional pode ser adicionado à parte externa do tubo de PE para evitar a entrada de ar no tórax.
2. Feche o músculo peitoral com um ponto X de polipropileno 5-0 acima e abaixo do nível do tubo PE e certifique-se de que a parte espessada do tubo PE esteja abaixo do nível do músculo.
3. Feche a pele com dois pontos em X de polipropileno 5-0 acima e dois abaixo do tubo de PE (Figura 1B e Figura 3).
4. Com o peito fechado, o animal pode respirar espontaneamente novamente. Desmame o animal do ventilador, reduzindo lentamente o volume corrente e a frequência respiratória. Quando o animal começar a respirar, desconecte espontaneamente o tubo do ventilador, mas mantenha-o no lugar até que um padrão respiratório estável seja observado.
5. Conecte o suprimento de isoflurano com um nariz que é colocado sobre o nariz do animal e fixado na placa de base.

6. Montagem da ferramenta IR remota

1. Coloque a parte lateral vertical na placa de base, inserindo-a nas fendas.
2. Use um gancho fino para recuperar as duas extremidades da sutura e puxe-as pelo orifício central na parte lateral atrás do balão (consulte a Tabela de Materiais).
3. Guie uma das extremidades das suturas acima e ao redor do balão. Siga com a outra extremidade da sutura sob e ao redor do balão. Aplique gel de ácido fusídico para uma orientação mais suave da sutura.
4. Guie as extremidades da sutura pelas fendas na parte superior da parte lateral. Na parte distal da sutura, aplique um peso de 2,1 g para manter cada extremidade da sutura no lugar (Figura 1C e Figura 4).
   NOTA: A configuração dos pesos apropriados está sujeita a alterações e deve ser testada previamente. Consulte a Figura Suplementar 1 e o Arquivo Suplementar 1 para obter detalhes. O design da ferramenta IRI remota é fornecido na Figura Suplementar 2.

7. Indução de isquemia e reperfusão

1. Induza a isquemia inflando imediatamente o balão usando a bomba de balão vascular até 2 bar. Bloqueie a bomba. Verifique visualmente se o balão está inflado e os pesos estão levantados (Figura 4).
2. Confirme a isquemia observando a alteração no traço do ECG.
3. Deixe o balão inflado pelo tempo definido de acordo com o protocolo específico do estudo (30 min nos experimentos apresentados).
4. Pare a oclusão simplesmente destravando a bomba. Esvazie o balão com cuidado. Verifique visualmente se o balão está vazio e os pesos estão abaixados.

8. Desmontagem da ferramenta IR remota

1. Corte a sutura e o tubo entre o animal e a parte lateral e remova cuidadosamente a parte lateral.
2. Aplique gel de ácido fusídico no local de inserção do tubo no tórax. Use uma pinça curva para empurrar suavemente a pele contra o tubo e use outra pinça para extrair o tubo. Corte qualquer sutura restante perto da pele.
3. Coloque uma sutura extra de polipropileno 5-0 para fechar o local de saída do tubo e minimizar o risco de entrada de ar no tórax.

9. Fim da narcose e recuperação

1. Pare o suprimento de isoflurano e permita que o animal acorde em um ambiente silencioso, quente e rico em oxigênio.
2. Confirme se o camundongo não está com nenhum desconforto respiratório, observando-o até a recuperação total. Forneça 0,3 mL de solução salina estéril (à temperatura corporal) por injeção intraperitoneal para evitar a desidratação.
3. Para analgesia pós-operatória, administre um analgésico opioide (buprenorfina, 0,1 mg / kg) por via subcutânea antes que o animal seja deambulatório. Verifique os camundongos a cada 4-6 h pelas próximas 24-48 h quando a buprenorfina for fornecida para garantir que os camundongos estejam respondendo aos analgésicos e para determinar se são necessários analgésicos adicionais. O suporte adicional deve incluir um gel ou purê de dieta de cuidados de suporte padrão recomendado colocado no chão da gaiola no pós-operatório.

Resultados

A validação da capacidade de induzir isquemia foi realizada por quatro testes: coloração com cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) e Sirius Red (SR), dosagem de troponina I cardíaca e ressonância magnética com realce tardio com gadolínio (LGE). A significância estatística foi avaliada por meio do teste não paramétrico de Mann-Whitney, considerando os tamanhos amostrais limitados. A significância estatística foi atribuída a p < 0,05.

Os experimentos agudos (coloração TTC, n = 15) não tiveram falha técnica e todos os animais foram incluídos. Esses experimentos agudos incluíram experimentos de acompanhamento imediato (troponina cardíaca I, LGE MRI, Sirius red staining, n = 12) e tiveram uma taxa de sobrevida de 85% e 80% para as técnicas de oclusão remota e padrão, respectivamente, durante um período de 4 semanas.

Coloração de cloreto de trifeniltetrazólio
A coloração TTC (cloreto de trifenil tetrazólio) em um modelo de camundongo de lesão de isquemia-reperfusão no coração mede macroscopicamente o fenômeno da viabilidade miocárdica, mostrando a perda de função da enzima desidrogenase. Este método de coloração ajuda a distinguir entre as áreas do coração que ainda são viáveis (vivas) e aquelas que se tornaram inviáveis devido à isquemia. O miocárdio viável fica vermelho com TTC, enquanto a área isquêmica permanece pálida ou não corada porque a enzima desidrogenase não é mais funcional. Isso fornece informações críticas sobre a extensão do dano tecidual logo após o início da isquemia. A coloração foi realizada para os grupos IRI padrão (n = 7) e IRI remota (n = 8) imediatamente após 30 min de isquemia. A Figura 5 mostra fatias coradas representativas de um animal, com fatias de tecido atravessando da base em direção ao ápice. Os resultados da coloração TTC são apresentados na Figura 6 e não mostram diferença significativa entre as duas técnicas de IRI. A coloração do TTC foi realizada conforme descrito por Fishbein et ^al.7.

Ressonância nuclear magnética (RNM) tardia com realce com gadolínio
Para medir de forma não invasiva a extensão da área isquêmica, a ressonância magnética LGE foi empregada 24 horas após a oclusão para os grupos IRI padrão (n = 5) e IRI remoto (n = 5). Os detalhes detalhados da aquisição são fornecidos no Arquivo Suplementar 1. A área de risco é medida como a % de tecido do ventrículo esquerdo nos três cortes mais apicais que excede os critérios de limiar detalhados no Arquivo Suplementar 1. A representação gráfica na Figura 7 demonstra que não foram observadas diferenças significativas entre a técnica de oclusão remota recém-proposta e o método convencional de 'tórax aberto' na avaliação das medidas de área de risco.

Coloração Sirius Red
O infarto do miocárdio, consequência da isquemia miocárdica, apresenta um problema sério para os indivíduos que sofrem de isquemia, pois resulta em uma redução da massa contrátil do coração, prejudicando sua capacidade de bombear sangue com eficiência. A Figura 8 explica ainda mais os achados usando a coloração Sirius Red 4 semanas após a oclusão para confirmar a localização da formação da cicatriz com base na área de risco representada pela ressonância magnética LGE e medir a extensão do tecido cicatricial. A coloração foi realizada para os grupos IRI padrão (n = 5) e IRI remoto (n = 5). Áreas vermelhas brilhantes marcam o núcleo necrótico do infarto, enquanto as partes laranja marcam o tecido viável. Finalmente, a Figura 9 relata os tamanhos finais das cicatrizes medidos usando a coloração Sirius Red em ambas as técnicas. O tamanho da cicatriz é calculado como a área do infarto corado dividida pela área total da parede livre do ventrículo esquerdo na placa de corte de tecido apical com espessura de 2,4 mm. A coloração Sirius Red foi realizada de acordo com Rittié⁸.

Troponina cardíaca I
Além das técnicas de imagem e coloração, o estudo também avaliou o dano cardíaco usando a troponina cardíaca I como marcador. Amostras de sangue foram coletadas 24 h após a cirurgia para os grupos IRI padrão (n = 8) e IRI remoto (n = 8). A Figura 10 mostra o valor da troponina cardíaca I, demonstrando que não há diferenças significativas ao comparar a nova técnica de oclusão remota com a técnica padrão de IRI.

Como demonstração da viabilidade do conceito proposto, também são fornecidos resultados preliminares de indução de isquemia de um local remoto com imagens não invasivas simultâneas. Isso foi conseguido utilizando a ferramenta de oclusão remota personalizada, que foi colocada dentro do berço do animal de ressonância magnética e posicionada no centro do scanner de ressonância magnética. Os resultados mostrados na Figura 11 demonstram diferenças no contraste da imagem (níveis de brilho) entre as regiões infartadas e não infartadas. O traçado de ECG mostrando a elevação típica do ST como um marcador confirmando a oclusão bem-sucedida da DA enquanto o animal está posicionado dentro do scanner de RM é apresentado na Figura 12B, enquanto a Figura 12A mostra o traçado de ECG antes da oclusão.

Essa abordagem abrangente fornece uma compreensão detalhada dos efeitos da técnica de oclusão remota recém-proposta na isquemia, necrose e dano cardíaco no modelo experimental em comparação com o método convencional de 'tórax aberto'.

Figura 1: Imagens representativas demonstrando o preparo do animal conforme descrito no protocolo. (A) Toracotomia com inserção de afastador de costela. (B) Fechamento do tórax com tubo PE-10 saindo do tórax e guiando a sutura ao redor da DA. (C) Posicionar o animal dentro da ferramenta IRI remota montada. Observe os dois pesos de 2,1 g prendendo cada extremidade da sutura e descansando na parte lateral do berço remoto do IRI. A parte lateral é posicionada e mantida no lugar pelos recortes na placa de base da ferramenta. O cateter de balão vascular é esvaziado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visualização ex vivo do LAD (seta branca) e da aurícula esquerda (seta preta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Vista esquemática de cima para baixo da configuração experimental, ilustrando a posição da ferramenta usada para oclusão remota. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Esquema ilustrando o uso da ferramenta para oclusão remota a partir de uma vista lateral. (A) Desde o início da cirurgia, o animal é colocado na parte inferior. Depois de fechar o baú, a parte lateral é instalada no lugar. Nesse ponto, o balão ainda está desinflado e os pesos estão apoiados na parte inferior. (B) Inflar o cateter balão levantará os pesos (marcados com setas) e causará oclusão da DA com subsequente isquemia para o miocárdio. A oclusão bem-sucedida é observada nas alterações no traçado do ECG. A desinflação do balão restaurará o fluxo sanguíneo através do LAD. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagens representativas de fatias de coração de camundongo coradas com cloreto de trifenil tetrazólio (TTC). As fatias são deslocadas da base ao ápice, da esquerda para a direita, começando na linha superior. (A) IRI padrão. (B) IRI remoto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Resultados da coloração TTC. A coloração TTC foi realizada 24 h após a oclusão para medir o tamanho do infarto. Os pontos de dados são apresentados como médias com MEV dos grupos IRI padrão (n = 7) e IRI remoto (n = 8). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Ressonância magnética tardia com realce com gadolínio. Área de risco 24 h após a oclusão, conforme delineado em três cortes apicais (não incluindo o próprio ápice) obtidos com ressonância magnética LGE. Os pontos de dados são apresentados como médias com SEM dos grupos IRI padrão (n = 5) e IRI remoto (n = 5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Validação do dispositivo de oclusão remota por RM após o procedimento de isquemia/reperfusão. Comparação representativa entre a área de risco, conforme delineado nas imagens de RM LGE em 1 dia após a oclusão e o tecido cicatricial definitivo corado com Sirius Red em 4 semanas após a oclusão. (AB) Fatias de eixo curto de um animal com oclusão remota e de bancada, respectivamente. A seta marca a área delimitada em risco. (CD) Cortes histológicos corados com Sirius Red dos mesmos respectivos animais confirmam que a formação final da cicatriz corresponde ao delineamento da área de risco com ressonância magnética 24 h após a oclusão. VE = ventrículo esquerdo. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 9: Resultados da coloração Sirius Red. A coloração Sirius Red foi realizada 4 semanas após a oclusão para medir a extensão da formação da cicatriz. Os pontos de dados são apresentados como médias com SEM dos grupos IRI padrão (n = 5) e IRI remoto (n = 5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Quantificação da concentração de troponina I cardíaca em soro de camundongo obtido 24 horas após a oclusão. Os pontos de dados de cTnI são apresentados como médias com SEM dos grupos IRI padrão (n = 8) e IRI remoto (n = 8). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: Os resultados preliminares obtidos pela utilização da ferramenta de oclusão remota proposta em combinação com a aquisição simultânea de ressonância magnética são mostrados. O mesmo corte do ventrículo médio na orientação do eixo curto de um animal antes, no momento e logo após a oclusão é apresentado. À esquerda, a fatia representativa da imagem mostra as bordas do miocárdio no início do experimento (antes de acionar o IRI). No meio, o mesmo corte de eixo curto é mostrado após 30 min de isquemia induzida remotamente. O cloreto de manganês (MnCl) foi utilizado como agente de contraste para destacar a região infartada (marcada em amarelo). O brilho foi ajustado manualmente e saturado para destacar as diferentes regiões do tecido. Observe a diferença de brilho entre a parede livre septal e lateral (marcada em amarelo). À direita, usando as mesmas configurações de brilho de antes, o mesmo corte de eixo curto é mostrado 20 minutos após a oclusão (estágio de reperfusão). A seta indica a região com maior brilho em relação ao tempo de oclusão, estipulando a captação do contraste no estágio de reperfusão e o encolhimento da região hipointensa inicial conforme delineado no momento da oclusão. VE = ventrículo esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12: Traçado de ECG capturado usando o sistema de monitoramento de ressonância magnética para confirmar o início da isquemia. (A) Traçado de ECG normal capturado antes da oclusão remota. (B) Traço de ECG capturado logo após a insuflação do balão no mesmo animal. A seta aponta a elevação do segmento ST, tipicamente considerada um marcador de sucesso no início da isquemia. Observa-se também um aumento nas frequências cardíaca e respiratória, além de uma diminuição na amplitude do sinal. O animal é posicionado no centro do scanner de RM nos estágios de oclusão e reperfusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Configuração de pesos. Gráfico de todos os pesos na função de deslocamento do dinamômetro usando o sistema remoto Balão (azul) vs. o sistema de polias original (laranja). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Projeto da ferramenta IRI remoto. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Detalhes sobre as propriedades da ferramenta IRI e técnicas de aquisição e análise de imagens. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A nova técnica de oclusão remota introduzida neste estudo oferece uma plataforma única para avançar na pesquisa no campo da modelagem de lesões de isquemia-reperfusão, evitando a necessidade de manipulação direta do vaso durante a cirurgia inicial e permitindo imagens multimodais simultâneas do miocárdio reperfundido precocemente. A caracterização abrangente, incluindo medições de troponina-I, ressonância magnética com contraste LGE, TTC e coloração SR, mostra que a técnica proposta é equivalente ao padrão-ouro atual (ou seja, ligadura de tórax aberto)⁹.

A técnica proposta tem múltiplas vantagens sobre a abordagem tradicional de ligação 'aberta' da ADA. Principalmente, reduz o tempo de tórax aberto durante a cirurgia para apenas 15 min, em oposição ao tempo de oclusão (30-60 min) mais o tempo cirúrgico (15 min) exigido na abordagem tradicional. Essa cirurgia cardíaca aberta minimizada pode mitigar o dano tecidual e a inflamação, mas precisaria de mais investigação. Além disso, o fechamento precoce da toracotomia permite o desmame do ventilador, possibilitando a respiração espontânea sob isoflurano durante os experimentos de isquemia-reperfusão. Isso tem o potencial de diminuir a lesão pulmonar induzida pelo ventilador e a inflamação associada, além de permitir uma resposta fisiologicamente mais precisa à isquemia e reperfusão miocárdica¹⁰.

Além disso, a técnica de oclusão remota oferece maior controle sobre o momento exato da indução da isquemia. Como prova de conceito, foi demonstrada a viabilidade e os resultados preliminares da indução e controle da isquemia miocárdica remotamente, enquanto o animal foi posicionado no centro do aparelho de RM. A capacidade de iniciar com precisão a isquemia após o fechamento do tórax permite que os pesquisadores cronometrem intervenções terapêuticas ou investigações adicionais e sincronizem o insulto isquêmico entre os sujeitos experimentais. Esse controle aumentado pode levar a uma indução mais precisa e consistente de IRI, o que é crítico para estudos mecanicistas e terapêuticos. No entanto, a extensão marginal da inalação de isoflurano durante a configuração da ressonância magnética cardíaca pode representar uma limitação para este estudo. Ou seja, a exposição prolongada ao isoflurano pode ter efeitos cardioprotetores adicionais, como demonstrado em estudos murinos, e precisaria de mais investigação para o modelo proposto¹¹.

A variação na extensão da lesão induzida é um desafio comum nos modelos IRI, muitas vezes decorrente de diferenças na execução cirúrgica ou anatomia variável¹². É importante ressaltar que o treinamento adequado do cirurgião afetará as taxas de mortalidade neste modelo, além de outras variáveis reconhecidas, como colocação de LAD, duração experimental, cepas de camundongos e antecedentes genéticos¹³. A escolha de agentes anestésicos e analgésicos também pode influenciar os resultados. Por experiência, este modelo exibe uma taxa de mortalidade geral próxima a 15%. A implementação de um controle rigoroso da dor e monitoramento vigilante de animais pode reduzir ainda mais a mortalidade.

Uma das direções convincentes indicadas por este trabalho é a aplicação potencial da técnica de oclusão remota na avaliação de intervenções terapêuticas nas fases iniciais da oclusão ou reperfusão.

Em conclusão, a técnica de oclusão remota representa um progresso promissor na modelagem do IRI, potencialmente refinando estudos mecanicistas e acelerando terapias direcionadas. Sua capacidade de reduzir o trauma cirúrgico, aumentar o controle sobre o tempo de isquemia e melhorar a consistência experimental ressalta sua importância. Ao explorar ainda mais a adaptabilidade da técnica, os pesquisadores podem liberar todo o seu potencial e contribuir para uma compreensão mais precisa das fases iniciais da indução de isquemia, reperfusão e a lesão de isquemia-reperfusão que a acompanha. Além disso, o efeito de diferentes estratégias de tratamento pode agora ser observado durante esses estágios iniciais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sutura de seda 2-0	Sharpoint Products	DC-2515N
5-0 sutura de polipropileno	Ethicon	8710H
7-0 sutura de polipropileno	Ethicon	8206H
ACCLARENT Dispositivo de inflação de balão	Johnson& Johnson MedTech	BID30
Acepromazina	Kela
BD Vialon 18 G	BD	381347
BD Vialon 20 G	BD	381334
Solução Betadine	Purdue Pharma	25655-41-8
Buprenorfina (Buprenex Injetável)	Reckitt Benkiser Healthcare	NDC 12496-0757-1
Carpa Zoom Styl Knijplood 2,1 g (pesos de pesca de chumbo)	Visdeal.nl
Dumont # 3 Fórceps	Fine Science Tools	11231-30
Dumont # 5 Fórceps	Fine Science Tools	11251-30
Tesoura Fina	Fine Science Tools	14040-10
Fucidine gel	Leo Pharma
Isoflurane	Abbott	NDC 5260-04-05
KD Espéculo de Olho de Camundongo/Rato	World Precision Instruments	501897
Espéculo de olho de rato/rato KD	Precision Instruments	501897
Ketamine	Dechra
Fonte de luz		Zeiss	KL 1500
	Bruker BioSpin, Ettlingen, Alemanha	BioSpec 70/30
NatriumChloride 0,9%	Baxter
Lâmpada de calor infravermelho noturno	Zoo Med Laboratories, Inc.	RS-75
ParaVision	Bruker BioSpin	versão 6.0.1
tubo de polietileno PE-10	SAI Tecnologias de infusão	PE-10
tubo de polietileno PE-50	SAI Tecnologias de infusão	PE-50
ferramenta IRI remota (PMMA)	monitor cirúrgico de
Instrumentos			Indus
Segmento v4.0	Medviso, segment.heiberg.se	R12067
Sequência de eco gradiente auto-fechada	Bruker BioSpin, Ettlingen, Alemanha	IntraGate, ParaVision 6.0.1
Suporte de Agulha Alongado Fino	Science Tools	12005-15
Câmara de Indução de Mouse/Rato Sure-Seal Conectores	de Tubulação EZ-178		da World Precision Instruments
, Poli, Forma Y	Westlab	072025-0001
Cateter de dilatação Ultraverse 035 PTA: balão RBP de 5 mm x 40 mm, 17 ATM em cateter de 130 cm de comprimento	Bard Peripheral Vascular, Inc.
Veet (creme depilatório)	Reckitt Benkiser Healthcare
Ventilator, MiniVent Modelo 845	Hugo Sachs	73-0043
Vidisic	BAUSCH & LOMB PHARMA	685313
Xylazine	Bayer

World Sistema de ressonância magnética LCD Software roedores caseiro 00801741092671