Método fluorescente sem células quantificável e barato para confirmar a capacidade de novos compostos de quelar ferro

Mudanças fenotípicas nas células relacionadas ao desenvolvimento do câncer por meio de um conjunto comum de capacidades biológicas alteradas são agora comumente chamadas de características do câncer. Entre elas estão as alterações resultantes da reprogramação do metabolismo energético, que são difundidas na biologia das células cancerígenas¹. Essa reprogramação metabólica inclui um aumento da necessidade de ferro para apoiar a rápida proliferação e o crescimento do tumor². Essa sede de ferro leva à desregulação do metabolismo do ferro, que por si só é considerada uma marca registrada do câncer ^3,4, com desregulação ocorrendo em todos os estágios⁵. As características da metástase, propostas mais recentemente por Welch e Hurst, incluem um papel para o ferro⁶, uma vez que o ferro pode induzir estresse oxidativo, e isso pode, por sua vez, mediar alterações no genoma, epigenoma e proteoma, aumentando a possibilidade de metástase⁷. Uma ligação entre os níveis de ferro e um aumento da ocorrência de câncer foi demonstrada por meio de estudos epidemiológicos⁸.

Como as células cancerígenas requerem grandes quantidades de ferro, elas são suscetíveis à deficiência de ferro e, portanto, à quelação de ferro. Publicamos recentemente um artigo de revisão destacando o potencial de quelação de ferro na reversão de várias características do câncer por meio do NDRG1, interrompendo as vias de sinalização oncogênica⁹. No entanto, o uso da quelação de ferro como terapia autônoma contra o câncer não produziu resultados positivos em ensaios clínicos devido à sua toxicidade, meia-vida curta, metabolismo rápido e mecanismos de resistência emergentes. No entanto, os quelantes de ferro mostraram-se promissores em investigações in vitro e in vivo , indicando que mais trabalho é necessário para desenvolver quelantes de ferro eficazes para a terapia do câncer. A quelação específica de ferro é uma estratégia validada na descoberta de medicamentos anticâncer, mas apenas algumas classes foram relatadas até o momento¹⁰.

A identificação e caracterização de novos quelantes de ferro requer a capacidade de medir seu efeito em vários desfechos. Muitos deles (como proliferação, apoptose, formação de espécies reativas de oxigênio) são rotineiramente medidos e têm sido descritos e revisados na literatura como métodos para avaliar as características do câncer¹¹. Ao avaliar um novo quelante de ferro, muitos grupos examinam rotineiramente o efeito nas atividades antiproliferativas e redox, bem como os efeitos no influxo ou efluxo de ferro. As técnicas de predição in silico ¹² aumentam ainda mais o crescente pool de quelantes de ferro que podem ser rastreados.

Acriação de quelantes de ferro requer a capacidade de medir seu efeito nos níveis de ferro como meio de demonstrar efetivamente a prova de princípio. Atualmente, o método mais comum para fazer isso é a citometria de fluxo¹³ , que é cara, demorada e pouco quantificável. A escolha do ensaio geralmente é baseada na disponibilidade de equipamento experimental, velocidade e custo de um ensaio. Portanto, a capacidade de quelar o ferro pode ser uma medida de ponto final negligenciada devido aos altos custos do equipamento e ao desafio de quantificar de forma rápida e reprodutível a força da quelação. Aqui, descrevemos um método fluorescente livre de células quantificável e barato para confirmar a capacidade de novos compostos de quelar o ferro.

1. Preparação da solução de estoque

1. Ao preparar soluções de estoques de calceína, evite a fotodegradação mantendo as soluções no escuro. Preparar uma solução de 1 mM de calceína em PBS de Dulbecco, sem magnésio ou cálcio¹⁴. Para 5 mL de solução de calceína 1 mM, adicione 3,1 mg de calceína (622,5 g / M) a 5 mL de PBS de Dulbecco. Usando a meia 1 mM de calceína, prepare alíquotas de 1 mL de soluções de estoque secundárias em tubo de microcentrífuga, conforme detalhado na Tabela 1.
2. Prepare estoques de hexahidrato de sulfato de amônio férrico dissolvendo 19 mg de hexahidrato de FAS (392,1 g / M) em 5 mL de PBS de Dulbecco para obter uma solução de sulfato de amônio férrico (FAS) de 10 mM. Preparar existências secundárias de FAS por diluição. Para preparar um estoque de 2 mM FAS (fA), dilua 200 μL do estoque de FAS de 10 mM com PBS com 800 μL de PBS de Dulbecco. Para preparar um estoque de 100 μM FAS (fB), diluir 50 μL de estoque fA com 950 μL de PBS de Dulbecco.
3. Para preparar 10 mM de estoque de deferiprona, dissolva 2,8 mg (139,15 g / M) em 2 mL de PBS de Dulbecco. Prepare estoques secundários de quelante de ferro 2mM diluindo 200 μL do estoque de 10 mM com 800 μL de PBS de Dulbecco.
   NOTA: Neste ensaio, o quelante de ferro de escolha deve ser dissolvido no PBS de Dulbecco sem magnésio ou cálcio. Como exemplo de trabalho, usamos o quelante de ferro Deferiprone.

2. Validação do ensaio por determinação da faixa linear da fluorescência da calceína

1. Prepare uma gama de estoques de calceína de 1 mM a 1 μM, conforme descrito na tabela de solução de estoque (ver Tabela 1). Mantenha as soluções de estoque no escuro para evitar a degradação fotoquímica.
2. Pipete 90 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para os poços A a H e 1 a 12 de uma placa de 96 poços usando uma pipeta manual de canal único ou uma pipeta manual multicanal.
3. Adicione 10 μL de estoque de calceína 1 mM na coluna 12, linhas A a H, da placa de 96 poços usando uma pipeta manual de canal único.
4. Adicione 10 μL do estoque de calceína de 800 μM pré-preparado (Tabela 1) a uma placa de 96 poços na coluna 11, linhas A a H, usando uma pipeta manual de canal único.
5. Repita o procedimento de adição com os estoques da Tabela 1 de modo que a coluna 10 contenha 10 μL do estoque de 400 μM e a coluna 9 contenha 10 μL do estoque de 200 μM, etc. Continue este procedimento passo a passo nas colunas até que a coluna 2 contenha 10 μL do estoque de 1 μM.
   NOTA: A concentração final de calceína em cada poço é 10 vezes menor do que as soluções estoque devido à diluição de 1:10.
6. Adicione 10 μL de PBS à coluna 1, linha A a E.
7. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min e ajustar o analisador num leitor de microplacas para uma excitação de 490 nm e deteção de 530 nm (ou conjunto de filtros adequado para fluorescência de Calcien).

3. Validação do ensaio portêmpera de íons Fe²⁺ para reduzir a fluorescência da calceína

1. Preparar uma reserva de calceína (cB) de 10 μM e uma reserva de FAS (fA) de 2 mM (ver quadro de materiais). Mantenha o caldo de calceína no escuro para evitar fotodegradação.
2. Usando uma pipeta manual de canal único ou uma pipeta manual multicanal, adicione 50 μL de PBS às colunas 2 a 10, linhas A a E. Não adicione PBS à coluna 11.
3. Adicione 100 μL de um estoque de FAS (fA) de 2 mM em uma placa de 96 poços na coluna 11 (linhas A a E) usando uma pipeta manual de canal único.
4. Usando uma pipeta manual multicanal, remova 50 μL de fA da coluna 11 e pipete-o para o PBS já na coluna 10, misture bem por pipetagem.
5. Continuar este procedimento de diluição dupla gradual nas colunas 9-2, linhas A a E da placa de 96 poços, e misturar por pipetagem.
6. Remover 50 μl de solução pipetando da coluna 2 e descartar a solução como resíduo.
7. Adicione 40 μL de PBS em todos os poços com uma solução neles, colunas 2-12, linhas A a E.
8. Adicione 90 μL de PBS à coluna 1 dos poços, linhas A-E. Esses poços atuam como um controle positivo de 1 μM de calceína e 0 μM de FAS.
9. Adicione 10 μL de estoque de calceína 10 μM (cB) em cada poço com uma solução (colunas 1 a 12, linhas A a E). Isso resulta em uma concentração máxima de 1000 μM FAS na coluna 11, com a concentração de FAS caindo pela metade para as colunas 10, 9, 8 até a coluna 2. Cada um dos poços resultantes das colunas contém 1 μM de calceína e uma diluição de FAS.
10. Adicione 100 μL de PBS à linha F das colunas 1 a 5 para o controle PBS sozinho. Adicione 100 μL de 2 mM de FAS à linha F das colunas 6 a 10 para controle isolado de FAS. Incube em temperatura ambiente por 10 min no escuro.
11. Analisar num leitor de microplacas regulado para excitação de 490 nm e detecção de 530 nm (ou conjunto de filtros adequado para fluorescência de calceína).

4. Ensaio para quantificar a capacidade dos quelantes de ferro de competir com o quelante fraco Calceína por íons Fe²⁺

1. Preparar um stock de calceína (cB) de 10 μM, um stock de FAS (fB) de 100 μM e os stocks de quelante de ferro de 2 mM, conforme descrito no quadro 1. Mantenha o caldo de calceína no escuro para evitar a fotodegradação.
2. Usando uma pipeta manual de canal único ou uma pipeta manual multicanal, adicione 50 μL de PBS às colunas 2 a 10, linhas A a E, de uma placa de 96 poços. Não adicione PBS à coluna 11.
3. Adicione 100 μL do estoque de 2 mM (fA) dos quelantes de ferro, em uma placa de 96 poços na coluna 11, linhas A a E, usando uma pipeta manual de canal único.
4. Usando uma pipeta manual multicanal, remova 50 μL de fA da coluna 11 e pipete-o para o PBS na coluna 10, linhas A a E, misturando bem por pipetagem.
5. Continuar este procedimento de diluição dupla gradual nas colunas restantes 9-2, linhas A a E da placa, misturar cada poço por pipetagem. Remova 50 μL da coluna 2 e descarte. Isso garante uma diluição dupla de 2 mM do quelante de ferro (deferiprona) nas colunas de placas de 96 poços 11 a 2, linhas A a E.
6. Pipete 30 μL de PBS em todos os poços com uma solução neles (por exemplo, colunas 2-11 linhas A a E).
7. Usando uma pipeta multicanal, adicione 10 μL de estoque FAS 100 μM (fB) nas colunas 2-12, linhas A a E. Isso resulta em uma concentração de 1 μM de calceína e 10 μM de FAS em cada poço e uma diluição dupla dos quelantes, com a concentração reduzindo pela metade cada coluna na placa, colunas 11-2, com a maior concentração de quelante de ferro a 1000 μM na coluna 11 poços A a E.
8. Usando uma pipeta multicanal, adicione 10 μL de estoque de calceína 10 μM (cB) nas colunas 2-12, linhas A a E.
9. Pipetar 80 μL de PBS e 10 μL de calceína (cB) e 10 μL de FAS (fB) para a coluna 1, fileiras A-E, usando uma pipeta. Misture amostras por pipetagem. Isso fornece o controle de 1 μM de calceína com 10 μM de FAS e sem quelante.
10. Pipetar 100 μL de PBS para as colunas 1 a 5 da linha F. Isso fornece o controle negativo do PBS.
11. Adicionar 100 μL de 2 mM de quelante de ferro (deferiprona) à linha F, colunas 6 a 10. Isso fornece ao quelante controle sozinho.
12. Incube em temperatura ambiente por 10 min no escuro. Analisar num leitor de microplacas multimodal regulado para excitação a 490 nm e deteção a 530 nm (ou conjunto de filtros adequado para fluorescência de Calcien).

5. Análise dos dados

1. Análise para validação do ensaio por determinação da faixa linear de fluorescência da calceína.
   1. Calcule as Unidades de Fluorescência Relativas (RFU) médias das linhas A-H para cada concentração de calceína nas colunas da placa de 96 poços da etapa 1 e plote em relação à concentração. Plote o gráfico de linhas da concentração de calceína no eixo x em relação à RFU média no eixo y e use uma regressão linear para fornecer a linha de melhor ajuste.
   2. Quantifique a significância estatística comparando as concentrações de calceína em cada coluna (2-11) com o controle de PBS na coluna 1 linhas A a E. Realize uma análise de variância (ANOVA) e aplique a análise post hoc usando a diferença mínima significativa (LSD) com um limite de p <0,001 para determinar a significância estatística (indicada por ** na Figura 1).
2. Análise para validação do ensaio por têmpera de íons Fe²⁺ para reduzir a fluorescência da calceína.
   1. Calcule as unidades de fluorescência relativas (RFU) médias das linhas A a E para cada concentração de FAS nas colunas 2-11. Representar graficamente a RFU média para cada concentração de FAS no eixo y. No eixo x, plote as concentrações de FAS usando uma escala Log2, pois distribui melhor os dados. Trace uma linha de melhor ajuste usando uma regressão linear.
   2. Quantificar a significância estatística comparando a média de cada coluna com a RFU média do controle de PBS, 1 μM de calceína, 0 μM de FAS (coluna 1, linha A a E). Realize uma análise post hoc de ANOVA com LSD com um limite de p <0,001 para determinar a significância estatística.
3. Análise para ensaio: Quantificando a capacidade dos quelantes de ferro de superar o quelante fraco Calceína por íons Fe²⁺ .
   1. Calcular as unidades de fluorescência relativas (RFU) médias das linhas A a E para cada concentração de quelante nas colunas 2-11. Plotar a RFU média para cada concentração de quelante no eixo y. No eixo x, plote as concentrações de quelante usando uma escala Log2, pois distribui melhor os dados.
   2. Quantificar a significância estatística comparando a média de cada coluna com a RFU média do controle de PBS 1 μM Calceína e 10 μM FAS (coluna 1 linha A a E). Realize uma análise post hoc de ANOVA com LSD com um limite de p <0,001 para determinar a significância estatística.

Para o método mostrado na etapa 2, este primeiro experimento (Figura 1) estabeleceu a faixa linear do leitor de placas de fluorescência de microtitulação ao detectar emissões fluorescentes de calceína. Nossos resultados representativos mostram uma ampla faixa linear de fluorescência de calceína de 0 a 100 μM. A ANOVA com análise post hoc de LSD demonstra que há diferenças estatisticamente significativas na RFU média para todas as concentrações de calceína quando comparadas a um controle de 0 μM de calceína. Em experimentos posteriores, a calceína 1 μM foi usada (etapas 3 e 4), pois produz diferenças estatisticamente significativas em relação ao controle de 0 μM e está dentro da faixa em que é comumente aplicada às células na forma de calceína AM na citometriade fluxo 13.

Para o método mostrado na etapa 3, demonstramos que quando o ferro na forma de Fe2+ é adicionado em uma faixa de 0-1000 μM (como FAS) a 1 μM de calceína, os íons Fe2+ resultam em uma diminuição linear na fluorescência da calceína (RFU). Isso permite a observação da extinção baseada em Fe2+ da fluorescência da calceína. A calceína, como um quelante de ferro fraco, liga o ferro e isso reduz a saída fluorescente. Na Figura 2, as concentrações de 8,9 μM de FAS e acima mostraram uma diminuição significativa, p<0,001, na fluorescência da calceína quando comparadas a 1 μM de calceína isoladamente. O uso de 8,9 μM de FAS correspondeu a uma redução de 33% na fluorescência da calceína (RFU média). Para experimentação adicional (etapa 4), 10 μM FAS foi usado, pois estava dentro da faixa de extinção fluorescente de calceína.

Para o método mostrado na etapa 4, a competição da calceína pelos íons Fe2+ por um quelante de ferro pode ser observada na Figura 3. O ferro na forma de Fe2+ diminui a fluorescência da calceína do controle de 1 μM e o quelante de ferro deferiprona aumenta essa fluorescência até um pico, liberando a têmpera de ferro da calceína e aumentando a fluorescência (RFU média). A deferiprona (usada como exemplo) em concentrações variando de 0,97-512 μM resultou em aumentos estatisticamente significativos na fluorescência, conforme observado com ANOVA e análise post hoc de LSD (p<0,001). A maior mudança de dobra foi uma mudança de 3 vezes na RFU média a 62,5 μM de quelante quando comparada ao controle de 1 μM de calceína AM e 10 μM de FAS. Acima de 512 μM de deferiprona não houve diferença estatisticamente significativa entre o quelante e o controle de 1 μM de calceína e 10 μM de FAS.

Figura 1: Concentrações de calceína e fluorescência (RFU) determinadas usando um leitor de placa de microtitulação fluorescente. As concentrações de calceína de 0-100 μM incubadas por 30 min e fluorescência (RFU) determinadas são mostradas aqui. Os dados mostram a média de 8 repetições por experimento e três experimentos independentes, as barras de erro mostram um intervalo de confiança de 95% na média. A significância estatística é denotada por ** onde p<0,001 conforme determinado usando ANOVA e análise post hoc LSD (calculada usando prisma de bloco gráfico). A RFU média da calceína de cada concentração é comparada com o controle de PBS e 0 μM de calceína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: O aumento da concentração de FAS resulta em uma diminuição linear na fluorescência da calceína. A concentração de FAS foi aumentada de 0-1000 μM, o que resultou em uma diminuição linear na fluorescência de 1 μM de calceína após 30 min de incubação em PBS Os dados mostrados são a média de 5 repetições por experimento e três experimentos independentes, as barras de erro mostram um intervalo de confiança de 95% na média. A significância estatística é denotada por ** onde p<0,001 conforme determinado usando ANOVA e análise post hoc LSD (calculada usando prisma de bloco gráfico). A RFU média da calceína de cada concentração de FAS e 1 μM de calceína é comparada com o controle de 1 μM de calceína 0 μM de FAS em PBS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Concentrações crescentes de deferiprona. A concentração de deferiprona foi aumentada de 0-1000 μM com incubação de 1 μM de calceína, 10 μM de FAS em PBS. A fluorescência foi medida em um leitor de microplacas multimodal. Os dados apresentados são a média de 5 repetições por experimento e três experimentos independentes, as barras de erro mostram um intervalo de confiança de 95% na média. A significância estatística é denotada por ** onde p<0,001 conforme determinado usando ANOVA e análise post-hoc LSD (calculada usando prisma de bloco de grafismo). A RFU média foi comparada a 1 μM de calceína em PBS com 10 μM de FAS e 0 μM de deferiprona. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Preparação do estoque secundário de calceína.

Os autores declaram não haver conflito de interesses.