Método fluorescente sem células quantificável e barato para confirmar a capacidade de novos compostos de quelar ferro

Resumo

Descrevemos um ensaio fluorescente que pode confirmar de forma rápida e barata a capacidade de novos compostos de quelar o ferro. O ensaio mede a capacidade dos compostos de superar a atividade de ligação de ferro da fraca sonda fluorescente quelante de ferro Calceína, resultando em um aumento quantificável na fluorescência quando ocorre a quelação.

Resumo

As células cancerígenas requerem grandes quantidades de ferro para manter sua proliferação. O metabolismo do ferro é considerado uma marca registrada do câncer, tornando o ferro um alvo válido para abordagens anticâncer. O desenvolvimento de novos compostos e a identificação de pistas para modificações posteriores exigem que sejam realizados ensaios de comprovação de mecanismo. Existem muitos ensaios para avaliar o impacto na proliferação; No entanto, a capacidade de quelar o ferro é uma medida importante e às vezes negligenciada devido aos altos custos do equipamento e ao desafio de quantificar de forma rápida e reprodutível a força da quelação. Aqui, descrevemos um método fluorescente livre de células quantificável e barato para confirmar a capacidade de novos compostos de quelar o ferro. Nosso ensaio depende do corante fluorescente barato disponível comercialmente Calcein, cuja fluorescência pode ser quantificada na maioria dos leitores de placas de microtitulação fluorescente. A calceína é um quelante de ferro fraco e sua fluorescência é extinta quando se liga ao Fe^2+/3+; a fluorescência é restaurada quando um novo quelante supera a calceína pelo Fe^{ligado 2+/3+}. A remoção da têmpera fluorescente e o aumento resultante da fluorescência permitem que a capacidade de quelação de um novo quelante putativo seja determinada. Portanto, oferecemos um ensaio barato e de alto rendimento que permite a triagem rápida de novos compostos quelantes candidatos.

Introdução

Mudanças fenotípicas nas células relacionadas ao desenvolvimento do câncer por meio de um conjunto comum de capacidades biológicas alteradas são agora comumente chamadas de características do câncer. Entre elas estão as alterações resultantes da reprogramação do metabolismo energético, que são difundidas na biologia das células cancerígenas¹. Essa reprogramação metabólica inclui um aumento da necessidade de ferro para apoiar a rápida proliferação e o crescimento do tumor². Essa sede de ferro leva à desregulação do metabolismo do ferro, que por si só é considerada uma marca registrada do câncer ^3,4, com desregulação ocorrendo em todos os estágios⁵. As características da metástase, propostas mais recentemente por Welch e Hurst, incluem um papel para o ferro⁶, uma vez que o ferro pode induzir estresse oxidativo, e isso pode, por sua vez, mediar alterações no genoma, epigenoma e proteoma, aumentando a possibilidade de metástase⁷. Uma ligação entre os níveis de ferro e um aumento da ocorrência de câncer foi demonstrada por meio de estudos epidemiológicos⁸.

Como as células cancerígenas requerem grandes quantidades de ferro, elas são suscetíveis à deficiência de ferro e, portanto, à quelação de ferro. Publicamos recentemente um artigo de revisão destacando o potencial de quelação de ferro na reversão de várias características do câncer por meio do NDRG1, interrompendo as vias de sinalização oncogênica⁹. No entanto, o uso da quelação de ferro como terapia autônoma contra o câncer não produziu resultados positivos em ensaios clínicos devido à sua toxicidade, meia-vida curta, metabolismo rápido e mecanismos de resistência emergentes. No entanto, os quelantes de ferro mostraram-se promissores em investigações in vitro e in vivo , indicando que mais trabalho é necessário para desenvolver quelantes de ferro eficazes para a terapia do câncer. A quelação específica de ferro é uma estratégia validada na descoberta de medicamentos anticâncer, mas apenas algumas classes foram relatadas até o momento¹⁰.

A identificação e caracterização de novos quelantes de ferro requer a capacidade de medir seu efeito em vários desfechos. Muitos deles (como proliferação, apoptose, formação de espécies reativas de oxigênio) são rotineiramente medidos e têm sido descritos e revisados na literatura como métodos para avaliar as características do câncer¹¹. Ao avaliar um novo quelante de ferro, muitos grupos examinam rotineiramente o efeito nas atividades antiproliferativas e redox, bem como os efeitos no influxo ou efluxo de ferro. As técnicas de predição in silico ¹² aumentam ainda mais o crescente pool de quelantes de ferro que podem ser rastreados.

Acriação de quelantes de ferro requer a capacidade de medir seu efeito nos níveis de ferro como meio de demonstrar efetivamente a prova de princípio. Atualmente, o método mais comum para fazer isso é a citometria de fluxo¹³ , que é cara, demorada e pouco quantificável. A escolha do ensaio geralmente é baseada na disponibilidade de equipamento experimental, velocidade e custo de um ensaio. Portanto, a capacidade de quelar o ferro pode ser uma medida de ponto final negligenciada devido aos altos custos do equipamento e ao desafio de quantificar de forma rápida e reprodutível a força da quelação. Aqui, descrevemos um método fluorescente livre de células quantificável e barato para confirmar a capacidade de novos compostos de quelar o ferro.

Protocolo

1. Preparação da solução de estoque

1. Ao preparar soluções de estoques de calceína, evite a fotodegradação mantendo as soluções no escuro. Preparar uma solução de 1 mM de calceína em PBS de Dulbecco, sem magnésio ou cálcio¹⁴. Para 5 mL de solução de calceína 1 mM, adicione 3,1 mg de calceína (622,5 g / M) a 5 mL de PBS de Dulbecco. Usando a meia 1 mM de calceína, prepare alíquotas de 1 mL de soluções de estoque secundárias em tubo de microcentrífuga, conforme detalhado na Tabela 1.
2. Prepare estoques de hexahidrato de sulfato de amônio férrico dissolvendo 19 mg de hexahidrato de FAS (392,1 g / M) em 5 mL de PBS de Dulbecco para obter uma solução de sulfato de amônio férrico (FAS) de 10 mM. Preparar existências secundárias de FAS por diluição. Para preparar um estoque de 2 mM FAS (fA), dilua 200 μL do estoque de FAS de 10 mM com PBS com 800 μL de PBS de Dulbecco. Para preparar um estoque de 100 μM FAS (fB), diluir 50 μL de estoque fA com 950 μL de PBS de Dulbecco.
3. Para preparar 10 mM de estoque de deferiprona, dissolva 2,8 mg (139,15 g / M) em 2 mL de PBS de Dulbecco. Prepare estoques secundários de quelante de ferro 2mM diluindo 200 μL do estoque de 10 mM com 800 μL de PBS de Dulbecco.
   NOTA: Neste ensaio, o quelante de ferro de escolha deve ser dissolvido no PBS de Dulbecco sem magnésio ou cálcio. Como exemplo de trabalho, usamos o quelante de ferro Deferiprone.

2. Validação do ensaio por determinação da faixa linear da fluorescência da calceína

1. Prepare uma gama de estoques de calceína de 1 mM a 1 μM, conforme descrito na tabela de solução de estoque (ver Tabela 1). Mantenha as soluções de estoque no escuro para evitar a degradação fotoquímica.
2. Pipete 90 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para os poços A a H e 1 a 12 de uma placa de 96 poços usando uma pipeta manual de canal único ou uma pipeta manual multicanal.
3. Adicione 10 μL de estoque de calceína 1 mM na coluna 12, linhas A a H, da placa de 96 poços usando uma pipeta manual de canal único.
4. Adicione 10 μL do estoque de calceína de 800 μM pré-preparado (Tabela 1) a uma placa de 96 poços na coluna 11, linhas A a H, usando uma pipeta manual de canal único.
5. Repita o procedimento de adição com os estoques da Tabela 1 de modo que a coluna 10 contenha 10 μL do estoque de 400 μM e a coluna 9 contenha 10 μL do estoque de 200 μM, etc. Continue este procedimento passo a passo nas colunas até que a coluna 2 contenha 10 μL do estoque de 1 μM.
   NOTA: A concentração final de calceína em cada poço é 10 vezes menor do que as soluções estoque devido à diluição de 1:10.
6. Adicione 10 μL de PBS à coluna 1, linha A a E.
7. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min e ajustar o analisador num leitor de microplacas para uma excitação de 490 nm e deteção de 530 nm (ou conjunto de filtros adequado para fluorescência de Calcien).

3. Validação do ensaio portêmpera de íons Fe²⁺ para reduzir a fluorescência da calceína

1. Preparar uma reserva de calceína (cB) de 10 μM e uma reserva de FAS (fA) de 2 mM (ver quadro de materiais). Mantenha o caldo de calceína no escuro para evitar fotodegradação.
2. Usando uma pipeta manual de canal único ou uma pipeta manual multicanal, adicione 50 μL de PBS às colunas 2 a 10, linhas A a E. Não adicione PBS à coluna 11.
3. Adicione 100 μL de um estoque de FAS (fA) de 2 mM em uma placa de 96 poços na coluna 11 (linhas A a E) usando uma pipeta manual de canal único.
4. Usando uma pipeta manual multicanal, remova 50 μL de fA da coluna 11 e pipete-o para o PBS já na coluna 10, misture bem por pipetagem.
5. Continuar este procedimento de diluição dupla gradual nas colunas 9-2, linhas A a E da placa de 96 poços, e misturar por pipetagem.
6. Remover 50 μl de solução pipetando da coluna 2 e descartar a solução como resíduo.
7. Adicione 40 μL de PBS em todos os poços com uma solução neles, colunas 2-12, linhas A a E.
8. Adicione 90 μL de PBS à coluna 1 dos poços, linhas A-E. Esses poços atuam como um controle positivo de 1 μM de calceína e 0 μM de FAS.
9. Adicione 10 μL de estoque de calceína 10 μM (cB) em cada poço com uma solução (colunas 1 a 12, linhas A a E). Isso resulta em uma concentração máxima de 1000 μM FAS na coluna 11, com a concentração de FAS caindo pela metade para as colunas 10, 9, 8 até a coluna 2. Cada um dos poços resultantes das colunas contém 1 μM de calceína e uma diluição de FAS.
10. Adicione 100 μL de PBS à linha F das colunas 1 a 5 para o controle PBS sozinho. Adicione 100 μL de 2 mM de FAS à linha F das colunas 6 a 10 para controle isolado de FAS. Incube em temperatura ambiente por 10 min no escuro.
11. Analisar num leitor de microplacas regulado para excitação de 490 nm e detecção de 530 nm (ou conjunto de filtros adequado para fluorescência de calceína).

4. Ensaio para quantificar a capacidade dos quelantes de ferro de competir com o quelante fraco Calceína por íons Fe²⁺

1. Preparar um stock de calceína (cB) de 10 μM, um stock de FAS (fB) de 100 μM e os stocks de quelante de ferro de 2 mM, conforme descrito no quadro 1. Mantenha o caldo de calceína no escuro para evitar a fotodegradação.
2. Usando uma pipeta manual de canal único ou uma pipeta manual multicanal, adicione 50 μL de PBS às colunas 2 a 10, linhas A a E, de uma placa de 96 poços. Não adicione PBS à coluna 11.
3. Adicione 100 μL do estoque de 2 mM (fA) dos quelantes de ferro, em uma placa de 96 poços na coluna 11, linhas A a E, usando uma pipeta manual de canal único.
4. Usando uma pipeta manual multicanal, remova 50 μL de fA da coluna 11 e pipete-o para o PBS na coluna 10, linhas A a E, misturando bem por pipetagem.
5. Continuar este procedimento de diluição dupla gradual nas colunas restantes 9-2, linhas A a E da placa, misturar cada poço por pipetagem. Remova 50 μL da coluna 2 e descarte. Isso garante uma diluição dupla de 2 mM do quelante de ferro (deferiprona) nas colunas de placas de 96 poços 11 a 2, linhas A a E.
6. Pipete 30 μL de PBS em todos os poços com uma solução neles (por exemplo, colunas 2-11 linhas A a E).
7. Usando uma pipeta multicanal, adicione 10 μL de estoque FAS 100 μM (fB) nas colunas 2-12, linhas A a E. Isso resulta em uma concentração de 1 μM de calceína e 10 μM de FAS em cada poço e uma diluição dupla dos quelantes, com a concentração reduzindo pela metade cada coluna na placa, colunas 11-2, com a maior concentração de quelante de ferro a 1000 μM na coluna 11 poços A a E.
8. Usando uma pipeta multicanal, adicione 10 μL de estoque de calceína 10 μM (cB) nas colunas 2-12, linhas A a E.
9. Pipetar 80 μL de PBS e 10 μL de calceína (cB) e 10 μL de FAS (fB) para a coluna 1, fileiras A-E, usando uma pipeta. Misture amostras por pipetagem. Isso fornece o controle de 1 μM de calceína com 10 μM de FAS e sem quelante.
10. Pipetar 100 μL de PBS para as colunas 1 a 5 da linha F. Isso fornece o controle negativo do PBS.
11. Adicionar 100 μL de 2 mM de quelante de ferro (deferiprona) à linha F, colunas 6 a 10. Isso fornece ao quelante controle sozinho.
12. Incube em temperatura ambiente por 10 min no escuro. Analisar num leitor de microplacas multimodal regulado para excitação a 490 nm e deteção a 530 nm (ou conjunto de filtros adequado para fluorescência de Calcien).

5. Análise dos dados

1. Análise para validação do ensaio por determinação da faixa linear de fluorescência da calceína.
   1. Calcule as Unidades de Fluorescência Relativas (RFU) médias das linhas A-H para cada concentração de calceína nas colunas da placa de 96 poços da etapa 1 e plote em relação à concentração. Plote o gráfico de linhas da concentração de calceína no eixo x em relação à RFU média no eixo y e use uma regressão linear para fornecer a linha de melhor ajuste.
   2. Quantifique a significância estatística comparando as concentrações de calceína em cada coluna (2-11) com o controle de PBS na coluna 1 linhas A a E. Realize uma análise de variância (ANOVA) e aplique a análise post hoc usando a diferença mínima significativa (LSD) com um limite de p <0,001 para determinar a significância estatística (indicada por ** na Figura 1).
2. Análise para validação do ensaio por têmpera de íons Fe²⁺ para reduzir a fluorescência da calceína.
   1. Calcule as unidades de fluorescência relativas (RFU) médias das linhas A a E para cada concentração de FAS nas colunas 2-11. Representar graficamente a RFU média para cada concentração de FAS no eixo y. No eixo x, plote as concentrações de FAS usando uma escala Log2, pois distribui melhor os dados. Trace uma linha de melhor ajuste usando uma regressão linear.
   2. Quantificar a significância estatística comparando a média de cada coluna com a RFU média do controle de PBS, 1 μM de calceína, 0 μM de FAS (coluna 1, linha A a E). Realize uma análise post hoc de ANOVA com LSD com um limite de p <0,001 para determinar a significância estatística.
3. Análise para ensaio: Quantificando a capacidade dos quelantes de ferro de superar o quelante fraco Calceína por íons Fe²⁺ .
   1. Calcular as unidades de fluorescência relativas (RFU) médias das linhas A a E para cada concentração de quelante nas colunas 2-11. Plotar a RFU média para cada concentração de quelante no eixo y. No eixo x, plote as concentrações de quelante usando uma escala Log2, pois distribui melhor os dados.
   2. Quantificar a significância estatística comparando a média de cada coluna com a RFU média do controle de PBS 1 μM Calceína e 10 μM FAS (coluna 1 linha A a E). Realize uma análise post hoc de ANOVA com LSD com um limite de p <0,001 para determinar a significância estatística.

Resultados

Para o método mostrado na etapa 2, este primeiro experimento (Figura 1) estabeleceu a faixa linear do leitor de placas de fluorescência de microtitulação ao detectar emissões fluorescentes de calceína. Nossos resultados representativos mostram uma ampla faixa linear de fluorescência de calceína de 0 a 100 μM. A ANOVA com análise post hoc de LSD demonstra que há diferenças estatisticamente significativas na RFU média para todas as concentrações de calceína quando comparadas a um controle de 0 μM de calceína. Em experimentos posteriores, a calceína 1 μM foi usada (etapas 3 e 4), pois produz diferenças estatisticamente significativas em relação ao controle de 0 μM e está dentro da faixa em que é comumente aplicada às células na forma de calceína AM na citometria^{de fluxo 13}.

Para o método mostrado na etapa 3, demonstramos que quando o ferro na forma de Fe²⁺ é adicionado em uma faixa de 0-1000 μM (como FAS) a 1 μM de calceína, os íons Fe²⁺ resultam em uma diminuição linear na fluorescência da calceína (RFU). Isso permite a observação da extinção baseada em Fe²⁺ da fluorescência da calceína. A calceína, como um quelante de ferro fraco, liga o ferro e isso reduz a saída fluorescente. Na Figura 2, as concentrações de 8,9 μM de FAS e acima mostraram uma diminuição significativa, p<0,001, na fluorescência da calceína quando comparadas a 1 μM de calceína isoladamente. O uso de 8,9 μM de FAS correspondeu a uma redução de 33% na fluorescência da calceína (RFU média). Para experimentação adicional (etapa 4), 10 μM FAS foi usado, pois estava dentro da faixa de extinção fluorescente de calceína.

Para o método mostrado na etapa 4, a competição da calceína pelos íons Fe²⁺ por um quelante de ferro pode ser observada na Figura 3. O ferro na forma de Fe²⁺ diminui a fluorescência da calceína do controle de 1 μM e o quelante de ferro deferiprona aumenta essa fluorescência até um pico, liberando a têmpera de ferro da calceína e aumentando a fluorescência (RFU média). A deferiprona (usada como exemplo) em concentrações variando de 0,97-512 μM resultou em aumentos estatisticamente significativos na fluorescência, conforme observado com ANOVA e análise post hoc de LSD (p<0,001). A maior mudança de dobra foi uma mudança de 3 vezes na RFU média a 62,5 μM de quelante quando comparada ao controle de 1 μM de calceína AM e 10 μM de FAS. Acima de 512 μM de deferiprona não houve diferença estatisticamente significativa entre o quelante e o controle de 1 μM de calceína e 10 μM de FAS.

Figura 1: Concentrações de calceína e fluorescência (RFU) determinadas usando um leitor de placa de microtitulação fluorescente. As concentrações de calceína de 0-100 μM incubadas por 30 min e fluorescência (RFU) determinadas são mostradas aqui. Os dados mostram a média de 8 repetições por experimento e três experimentos independentes, as barras de erro mostram um intervalo de confiança de 95% na média. A significância estatística é denotada por ** onde p<0,001 conforme determinado usando ANOVA e análise post hoc LSD (calculada usando prisma de bloco gráfico). A RFU média da calceína de cada concentração é comparada com o controle de PBS e 0 μM de calceína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: O aumento da concentração de FAS resulta em uma diminuição linear na fluorescência da calceína. A concentração de FAS foi aumentada de 0-1000 μM, o que resultou em uma diminuição linear na fluorescência de 1 μM de calceína após 30 min de incubação em PBS Os dados mostrados são a média de 5 repetições por experimento e três experimentos independentes, as barras de erro mostram um intervalo de confiança de 95% na média. A significância estatística é denotada por ** onde p<0,001 conforme determinado usando ANOVA e análise post hoc LSD (calculada usando prisma de bloco gráfico). A RFU média da calceína de cada concentração de FAS e 1 μM de calceína é comparada com o controle de 1 μM de calceína 0 μM de FAS em PBS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Concentrações crescentes de deferiprona. A concentração de deferiprona foi aumentada de 0-1000 μM com incubação de 1 μM de calceína, 10 μM de FAS em PBS. A fluorescência foi medida em um leitor de microplacas multimodal. Os dados apresentados são a média de 5 repetições por experimento e três experimentos independentes, as barras de erro mostram um intervalo de confiança de 95% na média. A significância estatística é denotada por ** onde p<0,001 conforme determinado usando ANOVA e análise post-hoc LSD (calculada usando prisma de bloco de grafismo). A RFU média foi comparada a 1 μM de calceína em PBS com 10 μM de FAS e 0 μM de deferiprona. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Concentração (μm)	Volume de (estoque de 1 mM)	Volume de PBS	Volume total
800	800 μL	200 μL	1 mL
400	400 μL	600 μL	1 mL
200	200 μL	800 μL	1 mL
100	100 μL	900 μL	1 mL
50	50 μL	950 μL	1 mL
25	25 μL	975 μL	1 mL
10	10 μL	990 μL	1 mL
6	6 μL	994 μL	1 mL
2	2 μL	998 μL	1 mL
1	1 μL	999 μL	1 mL

Tabela 1: Preparação do estoque secundário de calceína.

Discussão

A dependência excessiva dos cânceres do ferro para alimentar seu metabolismo torna a quelação do ferro uma adição potencial aos regimes terapêuticos⁴. No entanto, há uma capacidade limitada de rastrear rapidamente novos quelantes de íons metálicos quanto à sua capacidade de ligar íons de ferro. A sonda fluorescente comumente usada e amplamente disponível Calcein é conhecida por atuar como um quelante de ferro fraco e a ligação por íons de ferro extingue a fluorescência da Calceína. A fluorescência pode então ser recuperada competindo pela ligação ao ferro usando um quelante de ferro mais forte. A redução da fluorescência observada à medida que a calceína se liga ao ferro e a restauração da fluorescência quando ela é superada por um quelante mais forte fornece um método rápido e simples para a triagem de novos compostos com potencial quelante de ferro. Embora as técnicas baseadas em calceína¹³ já sejam usadas para visualizar a capacidade dos quelantes de se ligarem ao ferro nas células, essas técnicas requerem aparelhos de citometria de fluxo caros, são apenas semiquantitativas, requerem treinamento extensivo da equipe e o uso da forma mais cara de Calceína, Calcien-AM. Além disso, a técnica é pouco reprodutível e não facilita prontamente a determinação da significância dos dados por análise estatística. Portanto, criamos um método in vitro simples e barato que pode atuar como uma triagem de primeira passagem de novas habilidades quelantes de ferro de um composto. Este ensaio livre de células revoga a necessidade de métodos caros de cultura de células como uma tela de alto rendimento de primeira passagem para a capacidade de quelação de ferro.

Há um interesse crescente na triagem ou no desenvolvimento de novos quelantes de ferro que podem ser usados para combater cânceres devido à sua dependência do ferro para impulsionar suas adaptações metabólicas². Neste artigo, descrevemos uma técnica in vitro que pode ser usada para confirmar a capacidade de novos compostos de quelar o ferro, superando o quelante fraco Calcein. Isso permite uma triagem simples, quantitativa e barata de novos compostos por sua capacidade de quelação de ferro.

Uma das etapas críticas do protocolo é estabelecer a faixa linear do leitor de placas de microtitulação fluorescente (Figura 1). A calceína tem um amplo espectro de excitação e emissão fluorescente que gira em torno de um pico de excitação de 501 nm e um pico de emissão de 521 nm. No entanto, a faixa linear da calceína pode depender dos filtros usados para excitar e detectar as emissões de fluorescência da calceína, a faixa linear do fotomultiplicador usado na detecção também determinará em parte a faixa linear. Portanto, é importante primeiro estabelecer a faixa de concentrações nas quais a fluorescência da calceína é linear para garantir que o ensaio esteja funcionando dentro da faixa linear de calceína no leitor de placas fluorescentes. Dado que observamos linearidade entre 0 e 100 mM de calceína, isso mostra que a calceína tem uma ampla faixa linear. Além disso, os leitores de placas de microtitulação fluorescente geralmente têm conjuntos de filtros que podem medir a fluorescência da calceína, pois possui espectros semelhantes a alguns dos fluoróforos emissores de luz verde mais comumente usados. Portanto, este ensaio é amplamente aplicável a uma ampla gama de usuários.

O uso de FAS como doador de íons de ferro é preferido, pois fornece íons Fe²⁺ , que é o principal íon de ferro no pool de ferro lábil nas células. No entanto, resultados semelhantes aos mostrados aqui (Figura 2) foram alcançados com o cloreto de amônio férrico (FAC), que fornece Fe³⁺ (dados não mostrados). Portanto, o ensaio é compatível com ambos os estados redox de íons de ferro, ampliando a aplicabilidade aos quelantes com preferência por qualquer um desses estados redox.

Neste estudo, apresentamos dados para o quelante de ferro Deferiprona, no entanto, também avaliamos a capacidade de outros quelantes de ferro, incluindo a mimosina, de superar a calceína pela ligação de íons de ferro usando este ensaio (dados não mostrados). Uma das limitações do ensaio é que acima de 512 mM do quelante deferiprona não houve aumento estatisticamente significativo na fluorescência quando comparado a um controle de 1 μM de calceína e 10 μM de FAS. Não está claro por que concentrações mais altas de quelante não resultam em um aumento fluorescente, embora isso tenha sido observado com outros quelantes (dados não mostrados). No entanto, um composto terapêutico de chumbo deve agir <100 μM para que o ensaio funcione nas faixas de concentração necessárias para a eficácia do composto de chumbo.

Este ensaio, portanto, permite que qualquer quelante de ferro em potencial seja rapidamente examinado quanto à capacidade de quelar o ferro como prova de mecanismo. Este é um primeiro passo importante antes que os novos quelantes sejam rastreados em ensaios caros e trabalhosos baseados em células ou in vivo . Uma limitação deste ensaio é que ele é realizado usando solvente aquoso e, portanto, requer que o quelante seja solúvel em tampões aquosos. No entanto, dado que a maior concentração usada neste estudo foi 10 mM de deferiprona, que é um pequeno quelante de ferro lipofílico¹⁵, os quelantes com solubilidade aquosa limitada ainda podem ser testados.

Para concluir, o ensaio descrito aqui pode ser valioso na triagem de novos quelantes de ferro, que é um foco contínuo do desenvolvimento terapêutico do câncer.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sulfato de ferro amônio (II) hexahidratado	Sigma-Aldrich	215406	também conhecido como FAS
Calceína	Sigma-Aldrich	C0875
Deferiprone	Sigma-Aldrich	379409
Dulbecco′ s Solução salina tamponada com fosfato	Sigma-Aldrich	D5652	sem magnésio e cálcio
Greiner CELLSTAR 96 placas de poços	Sigma-Aldrich	M0812	qualquer placa de 96 poços opticamente transparente funcionará