A eficácia e os mecanismos de via subjacentes do tratamento com ShiDuGao para eczema de ânus com base em conjuntos de dados GEO e farmacologia de rede

O eczema anal é uma afecção alérgica da pele que acomete a região e mucosas perianais, apresentando diversas manifestações^clínicas1. Os sintomas característicos incluem eritema anal, pápulas, bolhas, erosão, exsudatos e crostas. Esses sintomas surgem principalmente devido a arranhões, espessamento e rugosidade da área afetada².

O eczema anal, caracterizado por duração prolongada da doença, crises recorrentes e tratamento desafiador, pode ter efeitos adversos na saúde física e mental dos pacientes³. A patogênese do eczema anal ainda não está clara, e a medicina moderna sugere que ele pode estar relacionado a lesões anais locais, dieta, ambiente, genética e outros fatores⁴. Além de evitar o contato com irritantes e potenciais alérgenos, o tratamento do eczema anal concentra-se principalmente em métodos como inibição da inflamação, antialérgicos e alívio do prurido⁵.

O ODS tem sido extensivamente utilizado para o tratamento do eczema anal e outras condições anais. O SDG regula a exsudação da pele anal, reduz a umidade, repara a pele anal e combate efetivamente o prurido ^6,7,8. Além disso, o ODS tem o potencial de regular a microbiota do periânus, melhorando o eczema do ânus ^9,10.

A farmacologia de rede, uma abordagem bioinformática nova e interdisciplinar de ponta no domínio da inteligência artificial e do big data, fornece uma exploração aprofundada da medicina tradicional chinesa. Esta disciplina enfatiza a exposição sistêmica de regras de correlação molecular entre drogas e doenças a partir de uma perspectiva de redes ecológicas. Tem sido extensivamente adotado para vários aspectos, incluindo a identificação de ingredientes ativos chave em extratos de ervas, decifrando seus mecanismos globais de ação, formulando combinações de medicamentos, e estudando a compatibilidade de prescrição. As prescrições tradicionais chinesas exibem os atributos de multicomponente e multialvo, significando sua adaptabilidade substancial ao domínio da farmacologia de rede. Impulsionados por essa metodologia, novas perspectivas têm surgido no exame de complexos sistemas da medicina tradicional chinesa, fornecendo suporte técnico robusto para racionalização de aplicações clínicas e inovação de fármacos 11,12,13,14.

Este estudo tem como objetivo explorar o mecanismo de efetividade dos ODS no tratamento do eczema anal. Este esforço investigativo buscou elucidar o mecanismo de administração tópica de medicamentos usando uma integração sinérgica da farmacologia de rede e conjuntos de dados GEO. Os resultados fornecem informações valiosas sobre a eficácia e os mecanismos subjacentes do ODS no manejo do eczema do ânus, indicando seu potencial como uma abordagem terapêutica eficaz para essa condição. O diagrama detalhado do fluxo de trabalho do estudo é apresentado na Figura 1.

Este estudo não se refere à aprovação ética e consentimento para participar. Os dados utilizados neste estudo foram obtidos de bancos de dados genéticos.

1. Predição de alvos de doenças

1. Acesse o banco de dados GeneCards (https://www.genecards.org) e o banco de dados online de herança mendeliana no homem (OMIM, https://www.omim.org), utilizando "eczema do ânus" como termo de busca para alvos de doenças.
2. Faça o download das planilhas dos alvos da doença. Exclua os alvos repetidos para obter os alvos de eczema do ânus.

2. Seleção dos componentes ativos

1. Pesquise a palavra-chave "índigo naturalis, cipreste dourado, gesso calcinado, calamina e galha chinesa" no banco de dados de farmacologia do sistema de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) para obter a lista dos ingredientes ativos candidatos e alvos dos ODS.
2. Confie o componente ao banco de dados suíço ADME (http://www.swissadme.ch/index.php), extraindo detalhes daqueles que exibem absorção de IG "alta", juntamente com pelo menos dois valores de DL "Sim" como elementos ativos.
   NOTA: Normalmente, apenas ingredientes com valores semelhantes a medicamentos (DL) ≥0,18 na base de dados são incluídos como ingredientes ativos.

3. Construção da rede PPI e triagem das proteínas centrais

1. Em Venny2.1( https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html), insira os alvos de ODS e eczema do ânus na LIST1 e LIST2, respectivamente. Uma representação visual da interseção é gerada instantaneamente. Clique na área compartilhada para revelar os alvos comuns na seção Resultados .
2. Acesse o banco de dados STRING (https://string-db.org/). Insira os destinos no campo Lista de Nomes . Em seguida, selecione Homo sapiens como o Organismo e prossiga com Procurar > Continuar.
3. Quando os resultados estiverem disponíveis, abra Configurações avançadas e selecione ocultar nós desconectados na rede. Na Pontuação Mínima de Interação Necessária, defina a confiança mais alta (0,900) e clique em Atualizar.
4. Clique em Exportações para baixar o texto da rede de interação proteína-proteína (PPI) nos formatos .png e .tsv.

4. Construção de uma rede droga-componente-doença-alvo

1. Abra o Cytoscape 3.9.1 e importe o arquivo .tsv mencionado na etapa 3.4. Clique na barra de estilos no painel de controle para otimizar a cor, a fonte e o lado dos nós de rede.
2. Para análise de topologia de rede, empregue a função Analisar Rede . Para obter genes hub, use o CytoHubba no software Cytoscape. Estabelecer a rede droga-componente-doença-alvo.

5. Análise de enriquecimento GO e KEGG

1. Acesse o site do Metascape (https://metascape.org/). Selecione um arquivo ou cole uma lista de genes na caixa de diálogo e clique no botão Enviar . Em seguida, selecione H. sapiens em Input as Species e Analysis as Species; depois disso, habilite a função Análise Personalizada .
2. Na opção de enriquecimento, selecione GO Molecular Functions, GO Biological Processes, GO Cellular Components e o banco de dados KEGG Pathway. Marque Selecionar clusters GO seletivos e clique no botão Análise de enriquecimento . Após a conclusão da barra de progresso, inicie um clique na Página de Relatório de Análise para recuperar os resultados do enriquecimento.

6. Análise do conjunto de dados do chip genético GEO

1. Busca e análise do conjunto de dados do chip do gene GEO (GDS3806) utilizando a ferramenta GEO2R (https://ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/) para investigar a expressão de genes centrais em diferentes grupos de dados (grupo controle-dermatite não-atópica; grupo experimental-dermatite atópica).
2. Entre no site do banco de dados GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Insira a palavra-chave ou o GEO Access e clique no botão Pesquisar . Selecione o melhor resultado correspondente. Encontre a série de referência (GSE26952).
3. Entre no site da ferramenta GEO2R (https://ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/), insira a série de referência na caixa Adesão GEO e clique no botão Definir . Selecione Dermatite atópica como o grupo experimental, selecione Controle não atópico como o grupo de controle e clique no botão Analisar . Depois que o cálculo for concluído, o resultado aparecerá.

7. Acoplamento molecular

1. Abra o banco de dados TCMSP e baixe a estrutura 3D dos ingredientes selecionados. Use a caixa de pesquisa Nome químico e pesquise os nomes de ingredientes selecionados para baixar os arquivos de estrutura 3D correspondentes no formato mol2.
2. Abra o banco de dados de proteínas RCSB (http://www.pdb.org/) e faça o download das estruturas cristalinas dos principais alvos. Na caixa de pesquisa, pesquise os nomes de destino e baixe os arquivos de estrutura cristalina correspondentes no formato pdb.
3. Importe ingredientes e arquivos de estrutura de destino para o software de análise. Exclua as moléculas de água clicando em Editar > Excluir Água. Adicione hidrogênios clicando em Editar > Hidrogênios > Adicionar. Defina os ingredientes como o ligante, selecione alvos inteiros como o receptor e execute o encaixe cego.
4. Determine a faixa de acoplamento molecular.
   1. Selecione o receptor e o ligante em sequência. Clique em Grid > Grid Box para ajustar a caixa de grade para incluir todo o modelo. Clique em Arquivo > Fechar salvando a corrente para salvar o status da caixa de grade. Salve arquivos no formato gpf.
   2. Clique em Executar > Executar Autogrid4 > Nome do arquivo do parâmetro > Procurar, selecione o arquivo gpf e clique no botão Iniciar .
5. Use o AutoDock 4 para realizar o encaixe molecular.
   1. Clique em Docking > Macromolecule > Set Rigid Filename para selecionar o receptor. Clique em Docking > Ligand > Open/ Escolha para selecionar o ligante.
   2. Clique em Docking > Search Parameters para definir algoritmos de operação e Docking > Docking Parameters para definir parâmetros de encaixe. Selecione o arquivo dpf e clique no botão Iniciar. Salve arquivos no formato dpf.
   3. Clique em Analisar > encaixe > Abrir, selecione o arquivo dlg, clique em Analisar > Macromolécula para abrir o receptor, clique em Analisar > Conformações > Jogar, Classificado por Energia para analisar os resultados. Clique em Definir Complexo de Reprodução > Gravação para salvar os resultados no formato pdbqt.
6. Importe os arquivos de encaixe para o software PyMOL para construir visualização adicional.
   1. Selecione o ligante e clique em Ação > Localizar > Contatos Polares > Outros Átomos no Objeto para exibir ligações de hidrogênio entre os ligantes e o ambiente externo. Clique em c para mudar de cor.
   2. Clique em Action > Extract Object. Clique em Mostrar > Sticks para mostrar a estrutura do stick do receptor. Identificar os resíduos ligados aos ligantes e mostrar a estrutura do palito.
   3. Clique em Hide > Sticks para ocultar a estrutura do stick do receptor. Clique em Assistente > Medição e clique em dois átomos em sequência. Clique em Rótulo > Resíduo para mostrar o rótulo dos resíduos. Ajuste a cor e a transparência do plano de fundo, se necessário. Clique em Arquivo > Exportar imagem para salvar a imagem.

Genes relacionados ao eczema do ânus, genes-alvo dos ODS e alvos comuns
Um total de 958 potenciais candidatos a genes foram examinados em Genecards e 634 em bancos de dados OMIM, enquanto duplicatas foram excluídas. Para obter uma compreensão abrangente dos genes relacionados ao eczema anal, os achados de vários bancos de dados foram amalgamados, produzindo um total de 958 genes distintos. Consequentemente, uma rede de interação proteína-proteína (IBP) específica para eczema anal foi meticulosamente formulada. O ODS é composto por cinco medicinas tradicionais chinesas: índigo naturalis, cipreste dourado, gesso calcinado, calamina e galha chinesa15,16. O principal componente do gesso calcinado é o sulfato de cálcio anidro (CaSO4), enquanto o principal componente da calamina é o carbonato de zinco (ZnCO3). Indigo naturalis, cipreste dourado e galha chinesa têm ingredientes complexos. A partir do banco de dados do TCMSP, os medicamentos contêm 92 componentes compostos, obtendo-se um total de 867 alvos confiáveis (Tabela 1).

Através da sobreposição de ambos os conjuntos de dados de genes-alvo, um total de 149 genes-alvo frequentemente co-ocorrendo foram identificados (Figura 2A), seguidos pela construção de uma rede de interação proteína-proteína (PPI) essencial (Figura 2B). Por meio de um método de triagem baseado em mediana para grau, proximidade e entre, 59 alvos-chave foram selecionados como alvos potenciais de drogas para eczema anal. As medianas dos escores de grau, proximidade e entrelinhas para os alvos principais foram 49, 40,31947 e 0,522, respectivamente. Os 10 principais genes com alto escore de grau incluíram AKT1, TNF, TP53, EGFR, STAT3, SRC, JUN, CASP3, HRAS e PTGS2 (Tabela 2). Esses genes são altamente relevantes para o eczema anal.

Percursos e redes que envolvem objectivos comuns
Os métodos de enriquecimento KEGG e GO foram utilizados para analisar 59 alvos-chave, revelando 218 vias associadas e mais de 3000 processos biológicos associados. A análise descobriu vias que se correlacionam fortemente com SDG e proteínas do eczema anal, incluindo infecção pelo vírus Cherry simplex 1, Shigelose, via de sinalização do TNF, resistência ao inibidor da tirosina quinase EGFR, infecção por citomegalovírus humano e via de sinalização do receptor de células T (Figura 3A). Essas vias relacionam-se principalmente a genes como AKT1, TNF, TP53, STAT3, SRC, EGFR e CASP3. A Figura 3B fornece uma representação detalhada dos genes e vias alvo. A análise do GO foi realizada nos processos biológicos (BP), composição celular (CC) e função molecular (MF) (Figura 4A). Os resultados sugerem que este estudo se concentra principalmente em alvos comuns para ODS e eczema anal em processos biológicos, com alguns relevantes para CC e MF. As funções biológicas que foram particularmente relevantes incluem fosforilação de peptidil-tirosina, modificação de peptidil-tirosina, regulação da adesão célula-célula, regulação positiva da adesão celular, ativação de células T, regulação da adesão célula-célula leucocitária (Figura 4B-D).

Prevendo a ligação dos componentes ativos dos ODS aos alvos do eczema do ânus
Com base nos valores medianos de grau, proximidade e entre, 59 alvos principais foram examinados, incluindo AKT1, TNF, TP53, EGFR, STAT3, SRC, JUN, CASP3, HRAS e PTGS2. Uma análise mais aprofundada do banco de dados do GEO revelou upregulation do PPARG, EGFR e TNF, enquanto PTPRC, MMP9, MAPK14 e CASP3 foram downregulated no grupo experimental (dermatite atópica) (Figura 5). Através da análise do enriquecimento da via gênica comum, determinou-se que esses genes participaram predominantemente da cascata de sinalização do TNF e da via de sinalização MAPK. Na via de sinalização do TNF, a expressão do TNF foi regulada para cima, enquanto a expressão de MMP9, MAPK14 e CASP3 foi regulada para baixo. Na via de sinalização MAPK, a expressão de EGFR e TNF foi regulada para cima, enquanto MAPK14 e CASP3 foram reguladas para baixo (Figura 6). Com base nesses achados, TNF, MAPK14 e CASP3 foram considerados como alvos potenciais na terapia dos ODS.

Para validar alvos candidatos em componentes ativos do SDG, a análise de docking foi usada para testar a precisão entre a estrutura do componente ativo e as proteínas-alvo potenciais. Essas proteínas-alvo estão envolvidas em várias conexões funcionais e são os nós altos da rede, sugerindo que elas desempenham um papel crucial na resposta dos ODS ao eczema anal. O valor negativo da energia de ligação de acoplamento indica a capacidade do ODS de se acoplar a alvos de doenças in vivo, com um valor mais negativo indicando acoplamento mais fácil. Nesta investigação, o acoplamento molecular bem sucedido dos componentes ativos do núcleo com o alvo chave foi alcançado, e a energia de ligação de acoplamento foi negativa, com valores inferiores a -1 kcal/mol. O índigo e a berberrubina têm boa atividade de ligação, com energia de ligação inferior a -5 kcal/mol (Tabela 3, Figura 7). Tomados juntos, estes resultados fornecem mais evidências de que estas proteínas correspondentes aos loci do gene podem actuar como alvos SDG no eczema do ânus.

Figura 1: Fluxo de trabalho de análise de farmacologia de rede. GO, Ontologia Gênica; KEGG, Enciclopédia de Genes e Genomas de Quioto; TCMSP, Banco de Dados e Plataforma de Análise de Farmacologia de Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa; GEO, Expressão Gênica Omnibus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Diagrama de Venn e rede PPI dos alvos comuns. (A) Diagrama de Venn de intersecção do alvo da droga e da doença. (B) Rede PPI de destino comum por STRING. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise do enriquecimento da via de KEGG. (A) Análise do enriquecimento da via de KEGG. As 10 principais vias de KEGG são classificadas de acordo com os valores de P em ordem crescente. (B) A conexão entre a via e o alvo: caminho (amarelo), alvos (vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise do enriquecimento do GO. (A) Resultados GO de três ontologias. (B) Gráfico de bolhas do processo biológico (PA). (C) Gráfico de bolhas do componente celular (CC). (D) Gráfico de bolhas de função molecular (MF). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Previsão do resultado dos alvos potenciais. (A) Mapa de calor da expressão do gene hub no banco de dados GEO, o grupo A é o grupo experimental (dermatite atópica) e o grupo B é o grupo controle (dermatite não atópica); (B) Os nós da rede PPI representam proteínas, as bordas representam as relações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: A via de sinalização. (A) Via de sinalização MAPK. (B) via de sinalização do TNF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Docking molecular de genes e ingredientes principais. Magenta representa os componentes centrais dos ODS, e azul representa os resíduos dos genes centrais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Ingredientes ativos nos ODS.

Tabela 2: Características dos 10 principais genes hub.

Tabela 3: A energia de ligação de encaixe molecular dos ingredientes e genes do núcleo.

Os autores não têm nada a revelar.