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Medição do teor de carbono em macrófagos das vias aéreas expostos a partículas contendo carbono

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DOI:

10.3791/66781

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12 de julho de 2024

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1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, Qingdao University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve um protocolo experimental detalhado para medir o teor de carbono de macrófagos das vias aéreas com o objetivo de avaliar a dose de exposição interna ao nível de exposição individual ao material particulado.

Resumo

Os macrófagos pulmonares exibem um padrão dose-dependente em partículas fagocitantes. Após o engolfamento, esses macrófagos são subsequentemente excretados com o escarro, tornando os macrófagos e partículas visíveis e quantificáveis à microscopia de luz. Notavelmente, o carbono elementar dentro do corpo dos mamíferos se origina exclusivamente de contaminantes externos. Consequentemente, o conteúdo de carbono nos macrófagos das vias aéreas (CCAM) serve como um biomarcador de exposição válido, estimando com precisão a exposição individual ao material particulado (PM) contendo carbono. Este artigo delineia um protocolo envolvendo coleta, preservação, processamento, preparação e coloração de escarro, bem como aquisição e análise de fotos de macrófagos. Após a remoção dos núcleos dos macrófagos, a proporção da área do citoplasma ocupada por partículas de carbono (PCOC) foi calculada para quantificar o teor de carbono em cada macrófago. Os resultados indicam uma elevação nos níveis de CCAM após a exposição ao MP contendo carbono. Em resumo, este método não invasivo, preciso, confiável e padronizado permite a medição direta de partículas de carbono dentro das células-alvo e é utilizado para quantificação em larga escala de CCAM individual por meio de escarro induzido.

Introdução

A poluição do ar ambiente está associada a mortes por doenças respiratórias e cardiovasculares, representando uma séria ameaça à saúde humana 1,2. Dados epidemiológicos indicam que a exposição crônica a material particulado ambiente menor ou igual a 2,5 μm de diâmetro (PM2,5) é responsável pela morte prematura de 4 a 9 milhões de pessoas em todo o mundo. O PM2.5 foi classificado como o quinto fator de risco mais importante para mortalidade global no Estudo Global de Carga de Doenças, Lesões e Fatores de Risco (GBD) de 20153,4,5,6. Estudos descobriram que a adesão às diretrizes de poluição do ar da OMS poderia evitar 51.213 mortes por ano por exposição ao PM2.53. Atualmente, a maioria dos estudos carece da avaliação da exposição intraindividual e se baseia apenas em avaliações brutas em locais de monitoramento regionais maiores, que estão longe dos níveis de exposição individual. Os biomarcadores disponíveis de exposição interna, como HAPs urinários e benzo(a)pireno, não refletem as associações entre exposições a partículas e efeitos na saúde 7,8,9. Isso leva à incapacidade de estabelecer uma relação precisa com os efeitos na saúde. Portanto, a busca por marcadores que reflitam o nível de exposição ao material particulado em um indivíduo é uma das chaves para uma avaliação precisa da exposição dos indivíduos.

As partículas inaladas nos brônquios podem ser excretadas com o escarro através de oscilações ciliares nos brônquios. A falta de um sistema de transporte de fluxo mucoso ciliado nos alvéolos significa que a principal via de depuração das partículas que entram nos alvéolos é por meio da fagocitose e translocação por macrófagos10,11. Com base na estrutura anatômica do pulmão, sua depuração de matéria estranha particulada insolúvel é lenta. Isso permite que o material particulado interaja com as células pulmonares por longos períodos e inicie vários efeitos biológicos, causando danos ao tecido pulmonar e outros órgãos12,13. A estimulação por material particulado leva à ativação de macrófagos, desencadeando uma cascata de fatores inflamatórios nos pulmões que podem causar uma resposta inflamatória sistêmica14. Considerando o papel crucial da citofagia de macrófagos na indução de tempestades de citocinas nos pulmões, teoriza-se que as partículas de carbono dos macrófagos pulmonares podem refletir a dose biologicamente eficaz de exposição a partículas nucleadas por carbono no ar15. Além disso, como não há agregação de carbono elementar em células de mamíferos e partículas contendo carbono podem ser observadas como material particulado preto sob um microscópio óptico, a coleta de macrófagos alveolares e brônquicos e a medição do conteúdo de carbono neles podem servir como um marcador para avaliar a exposição ao material particulado16.

Este estudo identificou um método para avaliar com precisão os níveis individuais de exposição ao material particulado, conhecido como Conteúdo de Carbono dos Macrófagos das Vias Aéreas (CCAM). Especificamente, amostras de escarro da população foram coletadas depois que os participantes inalaram solução salina hipertônica gerada por um nebulizador ultrassônico. Essas amostras foram então preservadas usando uma solução fixadora. Os macrófagos das vias aéreas foram isolados, corados e fotografados ao microscópio óptico para identificar macrófagos contendo partículas contendo carbono, que foram então quantificadas. Este método fornece um marcador biológico para avaliar com precisão os níveis individuais de exposição ao material particulado. Ele estabelece uma base metodológica para investigar a relação entre a exposição ao material particulado e os efeitos na saúde, servindo como base de pesquisa para explorar associações entre a exposição ao PM e resultados de saúde, como doenças pulmonares.

Protocolo

O estudo recebeu aprovação do Comitê de Ética Médica do Instituto de Saúde Ocupacional e Controle de Intoxicações do Centro Chinês de Controle e Prevenção de Doenças (NIOHP201604), com consentimento informado por escrito obtido de todos os indivíduos antes do estudo e coleta de amostras biológicas. Para este estudo, foram selecionados embaladores de negro de fumo que trabalhavam em uma fábrica de negro de fumo há mais de 1 ano e foram expostos a aerossóis de negro de fumo. Trabalhadores de uma fábrica de água sem exposição ocupacional significativa a fatores prejudiciais foram recrutados na área local como população de controle para estabelecer o estudo. Os seguintes critérios de inclusão e exclusão foram selecionados para a população do estudo: Os critérios de inclusão para packers de negro de fumo incluíram contato direto com negro de fumo durante a maioria dos turnos e um mínimo de um ano de trabalho na área de exposição ao negro de fumo. Os trabalhadores do sistema de abastecimento de água foram incluídos se não tivessem exposição ocupacional ao negro de fumo ou outros poluentes em seu ambiente de trabalho. Os critérios de exclusão abrangeram trabalhadores com doenças crônicas, como câncer, aqueles que foram submetidos à exposição a raios-X nos últimos três meses, indivíduos com histórico de tuberculose pulmonar, cirurgia pulmonar, miocardite viral, cardiopatia congênita, febre recente ou inflamação e trabalhadores que tomaram antibióticos recentemente. Os reagentes e os equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preservação do escarro

  1. Prepare a solução fixadora seguindo os passos abaixo:
    1. Derreta 2% de polietilenoglicol (PEG1500) em banho-maria. Tome 20 mL de PEG1500 derretido em um tubo de centrífuga. Adicione 20 mL de etanol a 50% ao tubo da centrífuga e agite bem a mistura para criar o licor-mãe.
    2. Despeje gradualmente 40 mL do licor-mãe em 960 mL de etanol a 50%. Agite bem a solução para formar a solução de fixação de Saccomanno. Armazene a solução em local fresco e escuro.
  2. Adicione 20-30 mL da solução fixadora preparada a um tubo de centrífuga contendo aproximadamente 2 mL de escarro. Misture bem o conteúdo.
    NOTA: Certifique-se de que o volume total não exceda 40 mL.
  3. Sele o tubo da centrífuga com uma película de vedação. Guarde-o em local fresco e escuro. Transporte o tubo para o laboratório para processamento posterior quando estiver pronto.
    NOTA: Sempre derreta PEG1500 em banho-maria e use conforme a dosagem prescrita.

2. Preparação da suspensão celular no escarro

  1. Prepare a solução digestiva dissolvendo 0,1 g de ditiotreitol em 100 mL de solução salina de acordo com a dosagem real. Conservar a solução preparada a 4 °C durante um período máximo de 48 h.
  2. Centrifugar o tubo que contém a expetoração a 1,998 x g durante 30 min a 4 °C.
  3. Descarte o sobrenadante. Adicione um volume igual de digestão de escarro ao precipitado. Vortex e agite bem a mistura.
    1. Coloque o tubo em banho-maria a 37 °C até a liquefação completa (10-15 min).
      NOTA: Agite continuamente o tubo durante o processo de liquefação.
  4. Filtrar a mistura liquefeita com uma membrana filtrante de 70 μm.
  5. Centrifugar a solução filtrada a 500 x g durante 7 min a 4 °C.
  6. Descarte o sobrenadante, retendo o precipitado celular.
  7. Ressuspenda o precipitado celular em tampão fosfato de Duchenne. Centrifugar a solução ressuspensa a 500 x g durante 7 min a 4 °C para obter um precipitado de células puras.

3. Preparação do esfregaço celular

  1. Adicione 200-600 μL de tampão fosfato ao sedimento celular. Misture bem o conteúdo; ajuste o volume do buffer com base nos resultados da contagem de células (apontar para >1,0 × 105 células).
  2. Pegue 20 μL da suspensão celular e crie um esfregaço celular usando o método do hematócrito17.
  3. Deixe o esfregaço secar naturalmente (dentro de 48 h). Fixe o esfregaço com uma solução de coloração disponível comercialmente por 10 s.
  4. Mergulhe o esfregaço em uma solução de coloração por 8 s. Durante a coloração, levante suavemente a corrediça para cima e para baixo e enxágue o excesso de mancha com água corrente.
  5. Manchar o esfregaço em solução de coloração B por 8 s. Levante a lâmina durante a coloração e enxágue o excesso de mancha em água corrente.
    NOTA: As soluções de coloração A e B estão disponíveis no kit de coloração disponível comercialmente.
  6. Mergulhe a lâmina em etanol anidro duas vezes, cada vez por 2-3 s.
  7. Depois de seco, aplique uma quantidade adequada de goma neutra. Sele a lâmina com lamínulas.

4. Análise quantitativa do CCAM

  1. Use um microscópio de luz com uma objetiva de lente a óleo de 100x. Capture imagens de macrófagos selecionados aleatoriamente, bem corados e morfologicamente intactos. Tire 50 fotos de macrófagos aleatoriamente para cada amostra.
  2. Realize a análise de imagem no software Image J seguindo os passos abaixo:
    1. Meça a escala e determine o comprimento real e a conversão pixel a pixel (282 pixels = 10 μm). Defina a escala na Imagem J (Analisar > Definir escala), insira Distância em pixels, comprimento real, unidade de comprimento (μm) e marque Global.
    2. Use uma forma irregular para delinear as células. Remova o plano de fundo (seleções à mão livre, Editar > Limpar fora). Meça a área total das células (Analisar > Medição).
    3. Recorte o núcleo (Editar > Recortar). Converta a imagem em tons de cinza para preto e branco (Tipo de > de imagem > 8 bits).
    4. Ajuste o valor da escala de cinza específico para cada coloração de célula para uma contagem precisa de partículas de carbono (Imagem > Ajustar > limite > Aplicar, Analisar >> Medição).
    5. Calcule o teor de carbono de 50 macrófagos por amostra com base na área medida e na análise de imagem no software Image J.

Resultados

O escarro, preservado e processado com a solução fixadora, exibiu morfologia de macrófagos intactos em microscópio óptico durante o exame morfológico. Os macrófagos exibiram núcleos celulares claros, redondos ou em forma de rim, facilmente coráveis. Após a coloração, os núcleos das células pareciam roxo-azulados, enquanto o citoplasma era rosa claro ou azul claro. O campo microscópico mostrou impurezas mínimas, o que facilitou a fácil identificação celular. Dentro das células, as partículas de carbono negro eram distintamente visíveis em pequenos agregados, permitindo a análise quantitativa de partículas de carbono.

Imagens representativas de macrófagos de escarro são apresentadas na Figura 1, representando números variados de partículas de carbono em diferentes células. Por exemplo, a Figura 1A não mostra partículas de carbono, enquanto a Figura 1D exibe a maior concentração. Os valores de MCCC foram medidos como 0,00%, 2,24%, 6,64% e 34,61% para macrófagos (A-D), respectivamente. Durante o processo de determinação dos parâmetros CCAM, foi realizada uma avaliação quantitativa do teor de carbono em cada macrófago para mitigar vieses decorrentes de variações no tamanho dos macrófagos e da sobreposição de partículas de carbono com núcleos celulares. O cálculo e a análise da MACC foram realizados para 50 macrófagos por sujeito do estudo, conforme mostrado na Figura 2.

O estudo selecionou empacotadores de negro de fumo (CBP) de uma fábrica específica de negro de fumo de acetileno como o grupo exposto e recrutou trabalhadores de bombas de água de estações de água locais, que não tinham exposição ocupacional aparente a fatores prejudiciais, como o grupo de controle (não-CBP). Os resultados apresentados na Figura 2 indicam um CCAM maior em trabalhadores de embalagens de negro de fumo em comparação com o grupo controle.

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Figura 1: Imagem microscópica óptica mostrando partículas de carbono dentro dos macrófagos das vias aéreas. A cor preta no citoplasma representa partículas de carbono. Os painéis (AD) retratam imagens representativas de macrófagos das vias aéreas, cada um exibindo níveis variados de CCAM. Os valores de CCAM para macrófagos em (A-D) foram 0,00%, 2,24%, 6,64% e 34,61%, respectivamente. O maior nível de CCAM foi observado em (D). Barras de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Níveis quantitativos de MACC na população. Cinquenta macrófagos citoplasmicamente intactos e bem corados foram selecionados aleatoriamente para análise e quantificação por sujeito do estudo. Os dados foram analisados por meio do teste t de Student: *P < 0,05. CBP: empacotadores de negro de fumo; Não-CBP: grupo controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este estudo apresenta um protocolo experimental detalhado para o uso de CCAM derivado de escarro induzido como um marcador biológico para exposição interna a material particulado atmosférico. O CCAM pode ser detectado e quantificado por meio de microscopia óptica, servindo como um biomarcador de exposição interna preciso que reflete a relação com os efeitos na saúde. Portanto, há a necessidade de estabelecer e otimizar um método de preservação de escarro induzido conveniente, confiável e eficiente e um método de quantificação de CCAM para padronizar os procedimentos metodológicos.

A determinação do teor de carbono dos macrófagos pulmonares envolve várias etapas, incluindo a coleta de macrófagos pulmonares, esfregaço, coloração, fotografia e análise de imagens. Atualmente, existem dois métodos de coleta de macrófagos pulmonares: escarro induzido e lavagem pulmonar, cada um com suas vantagens e limitações18,19. A lavagem pulmonar pode produzir muitos macrófagos pulmonares homogêneos, mas é um método de amostragem traumático que requer anestesia e outras condições médicas. Portanto, não é adequado para amostragem geral em larga escala da população. Em contraste, o escarro induzido é fácil de realizar, não invasivo e adequado para amostragem em larga escala da população em geral. Também permite a obtenção de amostras repetidas. A lavagem pulmonar obtém macrófagos de alvéolos ou bronquíolos distais, enquanto o escarro induzido obtém macrófagos que podem se originar das vias aéreas. Neste estudo, realizamos o escarro induzido seguindo o protocolo padrão publicado pela European Respiratory Society20.

A taxa de sucesso do escarro induzido é influenciada por vários fatores, incluindo a concentração de soro fisiológico inalatório nebulizado e a presença de doenças respiratórias no paciente 21,22,23. As amostras de escarro também podem conter saliva, o que pode interferir na medição do conteúdo de carbono dos macrófagos, reduzindo potencialmente a contagem de macrófagos das vias aéreas na amostra24. Os procedimentos operacionais deste estudo foram padronizados, os métodos foram simples e a reprodutibilidade foi alta. Observou-se que fatores como o tamanho do fluxo de inalação nebulizado, a adequação do tempo de indução e a presença de intervalos durante a indução afetaram a taxa de sucesso do escarro induzido. Essas considerações são importantes para garantir a medição precisa e confiável do CCAM como um biomarcador para a exposição ao material particulado.

A solução fixadora Saccomanno, consistindo de 50% de etanol e 2% de polietilenoglicol, é normalmente usada como fixador para preservar amostras biológicas como fluido de lavagem broncoalveolar. Neste estudo, pela primeira vez, essa solução fixadora foi utilizada para preservar o escarro obtido em investigações epidemiológicas de campo. Os resultados atenderam à quantificação subsequente de carbono em macrófagos, semelhante à preservação de células de escarro pela manhã para obter esfregaços claros de células cancerígenas25. Os procedimentos operacionais foram padronizados, os métodos foram diretos e a reprodutibilidade foi alta. As vantagens da preservação do escarro induzido neste estudo incluem (1) fácil configuração do fixador, (2) não é necessária refrigeração para preservação, o que é conveniente para pesquisas epidemiológicas em larga escala, e (3) as amostras podem ser preservadas em local fresco e longe da luz. Visão clara ao microscópio após a coloração, com núcleos identificáveis, impurezas mínimas e morfologia celular completa. Isso é superior ao processamento direto do escarro e à aplicação do esfregaço em termos de morfologia26.

Em relação aos métodos experimentais, os seguintes detalhes foram anotados: O escarro foi agitado periodicamente durante a digestão em banho-maria a 37 °C até ficar completamente liquefeito. Após a liquefação, a filtração em uma membrana de 70 μm foi feita antes da centrifugação para remover as impurezas para um fundo de coloração mais claro. Os precipitados celulares foram lavados novamente com DPBS antes de esfregar nas lâminas. O excesso de líquido foi removido durante a coloração lavando as lâminas com água corrente. Os porta-lâminas foram trocados entre a mancha I e a mancha II para evitar resíduos. Para a fotografia, macrófagos com morfologia completa e boa coloração foram selecionados aleatoriamente, afetando a quantificação do CCAM27.

As opções de software de análise quantitativa para este estudo incluem Image SXM e Image J28. O Image SXM requer edição manual de imagens antes da análise para aumentar a precisão, o que aumenta significativamente o tempo necessário. Também é limitado ao processamento de um único tipo de célula. Em contraste, o software Image J usado neste estudo oferece melhor especificidade no processamento de imagens e maior compatibilidade. Em outras disciplinas, métodos de microscopia de triagem de alto conteúdo têm sido empregados para a seleção e subsequente análise de células marcadas com fluorescência, alcançando operações automatizadas de alto rendimento. A direção futura da pesquisa metodológica pode envolver o desenvolvimento de rotulagem automatizada de macrófagos no escarro e procedimentos de triagem29. Durante o processamento da Imagem J, os fatores que influenciam a medição do CCAM incluem o conhecimento do medidor sobre as informações da amostra e a determinação dos limites de valor da escala de cinza. A adoção de uma abordagem cega pode reduzir o viés do observador, e algumas amostras podem precisar ser medidas repetidamente para avaliar a reprodutibilidade. A captura e análise de imagens independentes por dois indivíduos com experiência de alto nível podem aumentar a precisão da identificação de macrófagos.

O estudo empregou métodos padrão do Instituto Nacional de Segurança e Saúde Ocupacional (NIOSH) para avaliar a exposição dos indivíduos a partículas ocupacionais. Várias avaliações foram realizadas nos níveis de material particulado fino (PM2.5) e no teor de carbono elementar (CE) relacionado ao PM2.5 na área de embalagem de negro de fumo e nas áreas de trabalho dos trabalhadores da estação de água do grupo controle. Até 99,6% das partículas de negro de fumo (CB) tinham um diâmetro aerodinâmico menor que 2,5 μm e 96,7% eram menores que 1,0 μm. No outono de 2012, o nível médio de PM2,5 na instalação de embalagem CB era de 800 microgramas por metro cúbico, com um nível de EC relacionado a PM2,5 de 657,0 microgramas por metro cúbico 30,31. No outono de 2018, a média geométrica do CB foi de 637,4 μg/m3, e o nível de EC relacionado ao PM2,5 foi de 364,6 μg/m3. Em ambas as observações, a relação CE/CT excedeu 92,5%, consistente com o fato de que o CB é quase puro CE. Assim, pode-se inferir deste estudo que as partículas de carbono em macrófagos são derivadas principalmente da exposição ao negro de fumo30,31. Como resultado, a concentração de PM2,5 no ambiente de trabalho da população exposta ao negro de fumo neste estudo foi de 637,4 μg/m3, significativamente maior do que a concentração de PM2,5 no ambiente de trabalho da população controle (130,0 μg/m3) e cerca de cinco vezes maior do que a da população controle. Os níveis de carbono elementar na população exposta ao negro de fumo foram de 364,6 μg/m3, muito superiores aos 2,0 μg/m3 na população controle.

Em resumo, este estudo utilizou escarro hipertônico induzido por solução salina para coletar amostras, obter macrófagos pulmonares, fazer esfregaços celulares e quantificar o conteúdo de carbono em 50 macrófagos, usando o número mediano para representar o nível de conteúdo de carbono de macrófagos para cada indivíduo. Esta metodologia de pesquisa pode ser adaptada para amostras populacionais em larga escala e usada para avaliar com precisão o nível de exposição interna de um indivíduo ao material particulado.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82273669, 82241086, 42207488), pelo Programa de Bolsas Taishan da Província de Shandong (No. tsqn202211121) e pelo Programa de Inovação e Tecnologia para os Excelentes Jovens Acadêmicos do Ensino Superior da Província de Shandong (2022KJ295).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Canudos estéreis de 3 mLShanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD84202ES03
Tubo de centrífuga de 50 mLThermo Fisher Scientific, EUA339652
Álcool etílico absolutoSinopharm Group Chemical Reagent Co.LTD 64-17-5
Óleo de cedroShanghai McLean Biochemical Technology Co., LTDC805296
Coloração Diff-quick soluçãoShanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD40748ES76
DitiotreitolSolebo Bio Co., LTDD8220
Tampão de fosfato Duchenne (DPBS)Thermo Fisher Scientific, EUA14190144
Câmera de microscópioOlympus Corporation of JapanDP72
Goma de árvoreneutra Solebo Bio Co., LTDG8590
Membrana de filtro de nylon 70umBD Falcon Bioscience, EUA211755
Microscópio ópticoOlympus Corporation do JapãoBX60
PolietilenoglicolSinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD25322-68-3
UltracentrifugeThermo Fisher Scientific, EUASL40R
Corrediça viscosaJiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co. LTD
188105

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Reimpressões e permissões

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