Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada celular especializada que reveste a membrana de Bruch localizada entre os fotorreceptores e a coróide¹. As células RPE desempenham um papel crítico no funcionamento adequado da retina. As células RPE transportam glicose e vitamina A para os fotorreceptores, promovem a visão por re-isomerização de all-trans retinal em 11-cis retinal e mantêm segmentos externos do fotorreceptor através da fagocitose de segmentos externos derramados, removem a água do espaço sub-retiniano, formam a barreira hemato-retiniana externa através da presença de junções apertadas e secretam fatores de crescimento neurotrópicos (como o fator derivado do epitélio pigmentar, e Fator de Crescimento Básico de Fibroblastos) que suportam fotorreceptores². A disfunção das células do EPR está envolvida na patogênese de várias retinopatias, incluindo degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa e retinopatia diabética ^3,4,5. Estudos in vitro usando células RPE são essenciais para melhorar nossa compreensão da patogênese dessas doenças. As células primárias de EPR são muito preferidas para esses estudos, uma vez que as linhagens de células de EPR, embora prontamente disponíveis, carecem de características-chave das células primárias de EPR.

Enquanto várias espécies têm sido utilizadas como fontes de células primárias de EPR, os camundongos têm a vantagem de usar modificações genéticas para ajudar a entender a patogênese das retinopatias. Os protocolos descritos anteriormente para isolar células de EPR de roedores requerem o uso de animais neonatais, são demorados, exigem habilidade técnica ou não são adequados para cultura 6,7,8,9,10,11,12. Descrevemos um método simples e rápido para isolar células RPE de camundongos adultos que produzem culturas altamente puras dessas células.

O uso de animais neste estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Case Western Reserve University.

1. Preparação de reagentes

1. Prepare o meio tampão de lavagem suplementando a solução salina balanceada de Hank (HBSS), sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol com solução tampão HEPES 10 mM. Manter a solução a 4 °C até à utilização.
2. Prepare o meio RPE suplementando o meio de Eagle modificado de Dulbecco com 4,5 g/L de glicose, 1,25x suplemento GlutaMAX (concentração estoque 100x ou 200 mM; concentração final de 2,5 mM L-glutamina), com 10% de soro bovino fetal, 1% de penicilina/estreptomicina e 1x solução de aminoácidos não essenciais MEM (100x). Antes de usar, pré-aqueça o meio a 37 °C em banho-maria.

2. Extração de olho de rato

1. Eutanasiar o camundongo, preferencialmente com idade entre 3 e 14 semanas, usando um método de eutanásia aprovado pela IACUC (luxação cervical sob anestesia usando um coquetel de cetamina/xilazina a 0,1 mL por 20 g de camundongo [87,5 mg/kg de cetamina e 12,5 mg/kg de xilazina] foi o método usado neste estudo).
   NOTA: Olhos coletados de camundongos mais jovens facilitarão o aumento do rendimento de células epiteliais pigmentares da retina ao longo do tempo e estenderão a capacidade de passagens sucessivas.
2. Coloque o mouse de lado com o olho voltado para cima.
3. Coloque o dedo indicador e o polegar acima e abaixo do olho, respectivamente. Aplique pressão suavemente na estrutura óssea ao redor do olho para induzir a protrusão do globo ocular.
4. Insira a ponta da tesoura ligeiramente aberta embaixo do olho e gire suavemente o pulso para longe do olho 90° até que o olho se desprenda da órbita.
   NOTA: Não feche a tesoura para cortar o olho ou o nervo óptico, pois isso dificultará a dissecção da ocular.
5. Coloque imediatamente e role o olho em etanol a 70% por no máximo 5 s antes de transferi-lo para um meio tampão de lavagem mantido em gelo.
6. Sob um microscópio de dissecação, transfira um olho de cada vez para uma placa de Petri cheia de tampão de lavagem e tiras de gaze embebida.
7. Estabilize o olho segurando o nervo óptico com uma pinça. Faça suavemente uma incisão ao nível da ora serrata usando uma faca cirúrgica de 3,00 mm 45° ou lâmina de barbear de 0,009".
8. Usando uma tesoura Vannas, insira suavemente a tesoura na incisão e corte ao redor da circunferência da ora serrata até que o segmento anterior e o vítreo possam ser removidos e descartados.
9. Retire suavemente a retina da ocular usando uma pinça amarrada, com cuidado para não perturbar a camada de EPR.
   NOTA: Para facilitar a remoção da retina, encha uma pipeta de transferência com meio tampão de lavagem e aplique-a cuidadosamente nas bordas da ocular para levantar suavemente a retina.
10. Por fim, remova o nervo óptico e o excesso de tecido conjuntivo da ocular usando uma tesoura. Tenha cuidado para não perfurar a ocular.

3. Isolamento do EPR primário

1. Transfira a ocular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 1 mL de tripsina a 0,25% + EDTA a 0,02%.
   NOTA: Duas oculares podem ser adicionadas a uma alíquota de tripsina-EDTA para aumentar o rendimento do RPE cultivável.
2. Transferir os tubos de microcentrífuga para um banho-maria regulado para 37 °C e incubar durante 10 min. A cada 2 min, remova os tubos do banho-maria e bata firmemente o fundo do tubo 40 vezes na bancada.
3. Após 10 min, interrompa suavemente a ocular mecanicamente usando um P1000 ou uma pipeta sorológica de 2 mL, pipetando para cima e para baixo no máximo 3 vezes.
   NOTA: A fragmentação das folhas de EPR é essencial, pois as folhas grandes não aderem corretamente.
4. Neutralize a tripsina imediatamente colocando as folhas de EPR destacadas, mas não a ocular, em 0,5 mL de soro fetal bovino (FBS) em um tubo cônico de 15 mL.
5. Além disso, dilua a tripsina colocando 3 mL de mídia RPE gota a gota nas camadas de folhas FBS e RPE.
6. Centrifugue o RPE a 340 x g por 3 min.
7. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em uma quantidade adequada de meio RPE para uma placa de 24 poços (1,9 cm² / poço) ou uma placa de 48 poços (0,75 cm² / poço).
   NOTA: O ERP pode ser plaqueado em placas de poço revestidas com proteínas da matriz extracelular, especificamente laminina, colágeno IV ou fibronectina, para aumentar a adesão¹¹. O EPR também pode ser ressuspenso em 1 mL de meio RPE e colocado em camadas em um gradiente de separação de densidade de 40% para isolar ainda mais as células de EPR puro. Além disso, girar a placa a 340 x g por 3-5 min pode aumentar a adesão celular¹³.
8. Incubar a 37 °C a 5% de CO₂.

4. Cultura de EPR

1. Não interrompa o EPR isolado por pelo menos 3 dias. Após 72 h, remova cuidadosamente o meio antigo e substitua-o por um meio novo e pré-aquecido.
2. Troque o meio a cada 48 h após os primeiros 3 dias.
3. Assim que as células atingirem a confluência, passe as células usando 0,25% de tripsina + 0,02% de EDTA e reduza o FBS no meio RPE para 2%.
   NOTA: Anteriormente, foi relatado que o EPR primário iniciava a desdiferenciação após 5-7 passagens e começaria a perder sua forma hexagonal e pigmentação¹⁴.

O protocolo descrito foi usado em camundongos de fundo C57BL / 6. O gênero não parece alterar a capacidade de cultivar EPR. Camundongos com menos de 6 semanas produzem folhas de EPR limitadas em comparação com camundongos mais velhos, e mais olhos podem ser necessários para alcançar a confluência ideal. Após o isolamento, as células RPE levam cerca de 3 dias para se estabilizar e se ligar à placa de cultura de células. Aproximadamente 24 h após o isolamento, células redondas e pigmentadas que parecem anucleadas começaram a se estabelecer, mas não aderiram totalmente à placa (Figura 1A). Nas próximas 48-72 h, as células começam a se ligar e se espalhar, mantendo sua pigmentação escura e núcleo transparente (Figura 1B, C). Após 5 dias, os EPR aumentaram a confluência e começaram a formar contatos célula a célula que lembram uma monocamada polarizada com formato hexagonal (Figura 1D).

Os PSE isolados foram avaliados quanto à pureza e integridade da junção apertada após 6 dias em cultura. Os EPR foram avaliados pela primeira vez quanto à presença de isomerohidrolase retinóide ou proteína de 65 kDA do epitélio pigmentar da retina (RPE65), um marcador específico para EPR (Figura 2, verde). Além disso, para que o EPR forme uma única camada de células pigmentadas e hexagonais, as junções célula a célula devem permanecer intactas. A proteína de junção apertada-1 ou zonula occludens-1 (ZO-1) são proteínas de andaime vitais para a manutenção e integridade das junções apertadas entre células individuais de EPR14. As culturas isoladas confluentes de EPR mantiveram suas proteínas de junção intercelular, demonstradas pela coloração de ZO-1 encontrada na periferia da célula (Figura 2, vermelho). Uma vez que essas células atingem a confluência em grandes folhas, elas mantêm contatos célula a célula sem crescer demais por até 2 semanas. Estudos anteriores mostraram que o ZO-1 é altamente expresso por até 9 dias em cultura15. Marcadores adicionais usados em culturas de EPR primário incluem colágeno IV, CRALBP e OTX211.

Figura 1. Morfologia do RPE primário de camundongo cultivado em placa padrão de poliestireno de 24 poços. (A) RPE primário isolado de ambos os olhos de um camundongo C57BL / 6 e cultivado em um único poço de uma placa de poliestireno de 24 poços de cultura de tecidos não revestida diretamente após o isolamento. (B, C) Após 48 h e 72 h, o EPR primário começa a aderir à placa e formar células pigmentadas e binucleadas. (D) Após 5 dias, a microscopia de campo claro mostra as células hiperpigmentadas de formato hexagonal aumentando a confluência e começando a formar contatos célula a célula. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. O marcador específico de EPR, RPE-65, e o marcador de junção intercelular, ZO-1, são conservados em RPE murino primário isolado. O EPR primário de três camundongos C57BL/6 foi cultivado por 6 dias antes da fixação com paraformaldeído a 4%. As células foram permeabilizadas com 0,1% de Triton-X em PBS por 5 min, bloqueadas com 5% de soro de cabra normal e incubadas com anticorpos contra RPE-65 (verde) ou ZO-1 (vermelho). Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3. Representação esquemática simplificada do protocolo de isolamento do epitélio pigmentar da retina. Depois de remover o globo ocular do mouse, esterilize o olho mergulhando-o brevemente em etanol a 70% antes de passar para o tampão de lavagem. No tampão de lavagem, corte ao longo da ora serrata e remova o segmento anterior. Remova a retina e coloque a ocular em um tubo com tripsina / EDTA. Bata suavemente no tubo no balcão a cada 2 minutos por 10 minutos no total, transfira o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mL e centrifugue o pellet de RPE. Ressuspenda as células e a placa em uma placa de 24 ou 48 poços. Gráficos gerados usando BioRender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Não há divulgações financeiras ou não financeiras relevantes.