Artigo de método

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

DOI:

10.3791/66921

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24 de maio de 2024

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1Department of Pathology, Case Western Reserve University, 2Division of Infectious Diseases and HIV Medicine, Department of Medicine, Case Western Reserve University, 3Cole Eye Institute, Ophthalmic Research, Cleveland Clinic

Neste artigo

Resumo

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O epitélio pigmentar da retina (EPR) atua como uma barreira crucial entre a coróide e a retina, promovendo a saúde e a função dos tipos de células da retina, como os fotorreceptores. Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para isolar e cultivar EPR murino adulto.

Resumo

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As células epiteliais pigmentares da retina (EPR) são críticas para o funcionamento adequado da retina. A disfunção do EPR está envolvida na patogênese de doenças retinianas importantes, como degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa e retinopatia diabética. Apresentamos uma abordagem simplificada para o isolamento de EPR de olhos adultos murinos. Em contraste com os métodos relatados anteriormente, essa abordagem permite o isolamento e a cultura de EPR altamente puro de camundongos adultos. Este método simples e rápido não requer muita habilidade técnica e é alcançável com ferramentas e reagentes científicos básicos. Os EPR primários são isolados de camundongos de fundo C57BL/6 com idade entre 3 e 14 semanas por enucleação do olho seguida pela remoção do segmento anterior. A tripsinização enzimática e a centrifugação são usadas para dissociar e isolar o EPR da ocular. Em conclusão, essa abordagem oferece um protocolo rápido e eficaz para a utilização do EPR no estudo da função e doença da retina.

Introdução

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O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada celular especializada que reveste a membrana de Bruch localizada entre os fotorreceptores e a coróide1. As células RPE desempenham um papel crítico no funcionamento adequado da retina. As células RPE transportam glicose e vitamina A para os fotorreceptores, promovem a visão por re-isomerização de all-trans retinal em 11-cis retinal e mantêm segmentos externos do fotorreceptor através da fagocitose de segmentos externos derramados, removem a água do espaço sub-retiniano, formam a barreira hemato-retiniana externa através da presença de junções apertadas e secretam fatores de crescimento neurotrópicos (como o fator derivado do epitélio pigmentar, e Fator de Crescimento Básico de Fibroblastos) que suportam fotorreceptores2. A disfunção das células do EPR está envolvida na patogênese de várias retinopatias, incluindo degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa e retinopatia diabética 3,4,5. Estudos in vitro usando células RPE são essenciais para melhorar nossa compreensão da patogênese dessas doenças. As células primárias de EPR são muito preferidas para esses estudos, uma vez que as linhagens de células de EPR, embora prontamente disponíveis, carecem de características-chave das células primárias de EPR.

Enquanto várias espécies têm sido utilizadas como fontes de células primárias de EPR, os camundongos têm a vantagem de usar modificações genéticas para ajudar a entender a patogênese das retinopatias. Os protocolos descritos anteriormente para isolar células de EPR de roedores requerem o uso de animais neonatais, são demorados, exigem habilidade técnica ou não são adequados para cultura 6,7,8,9,10,11,12. Descrevemos um método simples e rápido para isolar células RPE de camundongos adultos que produzem culturas altamente puras dessas células.

Protocolo

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O uso de animais neste estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Case Western Reserve University.

1. Preparação de reagentes

  1. Prepare o meio tampão de lavagem suplementando a solução salina balanceada de Hank (HBSS), sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol com solução tampão HEPES 10 mM. Manter a solução a 4 °C até à utilização.
  2. Prepare o meio RPE suplementando o meio de Eagle modificado de Dulbecco com 4,5 g/L de glicose, 1,25x suplemento GlutaMAX (concentração estoque 100x ou 200 mM; concentração final de 2,5 mM L-glutamina), com 10% de soro bovino fetal, 1% de penicilina/estreptomicina e 1x solução de aminoácidos não essenciais MEM (100x). Antes de usar, pré-aqueça o meio a 37 °C em banho-maria.

2. Extração de olho de rato

  1. Eutanasiar o camundongo, preferencialmente com idade entre 3 e 14 semanas, usando um método de eutanásia aprovado pela IACUC (luxação cervical sob anestesia usando um coquetel de cetamina/xilazina a 0,1 mL por 20 g de camundongo [87,5 mg/kg de cetamina e 12,5 mg/kg de xilazina] foi o método usado neste estudo).
    NOTA: Olhos coletados de camundongos mais jovens facilitarão o aumento do rendimento de células epiteliais pigmentares da retina ao longo do tempo e estenderão a capacidade de passagens sucessivas.
  2. Coloque o mouse de lado com o olho voltado para cima.
  3. Coloque o dedo indicador e o polegar acima e abaixo do olho, respectivamente. Aplique pressão suavemente na estrutura óssea ao redor do olho para induzir a protrusão do globo ocular.
  4. Insira a ponta da tesoura ligeiramente aberta embaixo do olho e gire suavemente o pulso para longe do olho 90° até que o olho se desprenda da órbita.
    NOTA: Não feche a tesoura para cortar o olho ou o nervo óptico, pois isso dificultará a dissecção da ocular.
  5. Coloque imediatamente e role o olho em etanol a 70% por no máximo 5 s antes de transferi-lo para um meio tampão de lavagem mantido em gelo.
  6. Sob um microscópio de dissecação, transfira um olho de cada vez para uma placa de Petri cheia de tampão de lavagem e tiras de gaze embebida.
  7. Estabilize o olho segurando o nervo óptico com uma pinça. Faça suavemente uma incisão ao nível da ora serrata usando uma faca cirúrgica de 3,00 mm 45° ou lâmina de barbear de 0,009".
  8. Usando uma tesoura Vannas, insira suavemente a tesoura na incisão e corte ao redor da circunferência da ora serrata até que o segmento anterior e o vítreo possam ser removidos e descartados.
  9. Retire suavemente a retina da ocular usando uma pinça amarrada, com cuidado para não perturbar a camada de EPR.
    NOTA: Para facilitar a remoção da retina, encha uma pipeta de transferência com meio tampão de lavagem e aplique-a cuidadosamente nas bordas da ocular para levantar suavemente a retina.
  10. Por fim, remova o nervo óptico e o excesso de tecido conjuntivo da ocular usando uma tesoura. Tenha cuidado para não perfurar a ocular.

3. Isolamento do EPR primário

  1. Transfira a ocular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 1 mL de tripsina a 0,25% + EDTA a 0,02%.
    NOTA: Duas oculares podem ser adicionadas a uma alíquota de tripsina-EDTA para aumentar o rendimento do RPE cultivável.
  2. Transferir os tubos de microcentrífuga para um banho-maria regulado para 37 °C e incubar durante 10 min. A cada 2 min, remova os tubos do banho-maria e bata firmemente o fundo do tubo 40 vezes na bancada.
  3. Após 10 min, interrompa suavemente a ocular mecanicamente usando um P1000 ou uma pipeta sorológica de 2 mL, pipetando para cima e para baixo no máximo 3 vezes.
    NOTA: A fragmentação das folhas de EPR é essencial, pois as folhas grandes não aderem corretamente.
  4. Neutralize a tripsina imediatamente colocando as folhas de EPR destacadas, mas não a ocular, em 0,5 mL de soro fetal bovino (FBS) em um tubo cônico de 15 mL.
  5. Além disso, dilua a tripsina colocando 3 mL de mídia RPE gota a gota nas camadas de folhas FBS e RPE.
  6. Centrifugue o RPE a 340 x g por 3 min.
  7. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em uma quantidade adequada de meio RPE para uma placa de 24 poços (1,9 cm2 / poço) ou uma placa de 48 poços (0,75 cm2 / poço).
    NOTA: O ERP pode ser plaqueado em placas de poço revestidas com proteínas da matriz extracelular, especificamente laminina, colágeno IV ou fibronectina, para aumentar a adesão11. O EPR também pode ser ressuspenso em 1 mL de meio RPE e colocado em camadas em um gradiente de separação de densidade de 40% para isolar ainda mais as células de EPR puro. Além disso, girar a placa a 340 x g por 3-5 min pode aumentar a adesão celular13.
  8. Incubar a 37 °C a 5% de CO2.

4. Cultura de EPR

  1. Não interrompa o EPR isolado por pelo menos 3 dias. Após 72 h, remova cuidadosamente o meio antigo e substitua-o por um meio novo e pré-aquecido.
  2. Troque o meio a cada 48 h após os primeiros 3 dias.
  3. Assim que as células atingirem a confluência, passe as células usando 0,25% de tripsina + 0,02% de EDTA e reduza o FBS no meio RPE para 2%.
    NOTA: Anteriormente, foi relatado que o EPR primário iniciava a desdiferenciação após 5-7 passagens e começaria a perder sua forma hexagonal e pigmentação14.

Resultados

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O protocolo descrito foi usado em camundongos de fundo C57BL / 6. O gênero não parece alterar a capacidade de cultivar EPR. Camundongos com menos de 6 semanas produzem folhas de EPR limitadas em comparação com camundongos mais velhos, e mais olhos podem ser necessários para alcançar a confluência ideal. Após o isolamento, as células RPE levam cerca de 3 dias para se estabilizar e se ligar à placa de cultura de células. Aproximadamente 24 h após o isolamento, células redondas e pigmentadas que parecem anucleadas começaram a se estabelecer, mas não aderiram totalmente à placa (Figura 1A). Nas próximas 48-72 h, as células começam a se ligar e se espalhar, mantendo sua pigmentação escura e núcleo transparente (Figura 1B, C). Após 5 dias, os EPR aumentaram a confluência e começaram a formar contatos célula a célula que lembram uma monocamada polarizada com formato hexagonal (Figura 1D).

Os PSE isolados foram avaliados quanto à pureza e integridade da junção apertada após 6 dias em cultura. Os EPR foram avaliados pela primeira vez quanto à presença de isomerohidrolase retinóide ou proteína de 65 kDA do epitélio pigmentar da retina (RPE65), um marcador específico para EPR (Figura 2, verde). Além disso, para que o EPR forme uma única camada de células pigmentadas e hexagonais, as junções célula a célula devem permanecer intactas. A proteína de junção apertada-1 ou zonula occludens-1 (ZO-1) são proteínas de andaime vitais para a manutenção e integridade das junções apertadas entre células individuais de EPR14. As culturas isoladas confluentes de EPR mantiveram suas proteínas de junção intercelular, demonstradas pela coloração de ZO-1 encontrada na periferia da célula (Figura 2, vermelho). Uma vez que essas células atingem a confluência em grandes folhas, elas mantêm contatos célula a célula sem crescer demais por até 2 semanas. Estudos anteriores mostraram que o ZO-1 é altamente expresso por até 9 dias em cultura15. Marcadores adicionais usados em culturas de EPR primário incluem colágeno IV, CRALBP e OTX211.

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Figura 1. Morfologia do RPE primário de camundongo cultivado em placa padrão de poliestireno de 24 poços. (A) RPE primário isolado de ambos os olhos de um camundongo C57BL / 6 e cultivado em um único poço de uma placa de poliestireno de 24 poços de cultura de tecidos não revestida diretamente após o isolamento. (B, C) Após 48 h e 72 h, o EPR primário começa a aderir à placa e formar células pigmentadas e binucleadas. (D) Após 5 dias, a microscopia de campo claro mostra as células hiperpigmentadas de formato hexagonal aumentando a confluência e começando a formar contatos célula a célula. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. O marcador específico de EPR, RPE-65, e o marcador de junção intercelular, ZO-1, são conservados em RPE murino primário isolado. O EPR primário de três camundongos C57BL/6 foi cultivado por 6 dias antes da fixação com paraformaldeído a 4%. As células foram permeabilizadas com 0,1% de Triton-X em PBS por 5 min, bloqueadas com 5% de soro de cabra normal e incubadas com anticorpos contra RPE-65 (verde) ou ZO-1 (vermelho). Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3. Representação esquemática simplificada do protocolo de isolamento do epitélio pigmentar da retina. Depois de remover o globo ocular do mouse, esterilize o olho mergulhando-o brevemente em etanol a 70% antes de passar para o tampão de lavagem. No tampão de lavagem, corte ao longo da ora serrata e remova o segmento anterior. Remova a retina e coloque a ocular em um tubo com tripsina / EDTA. Bata suavemente no tubo no balcão a cada 2 minutos por 10 minutos no total, transfira o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mL e centrifugue o pellet de RPE. Ressuspenda as células e a placa em uma placa de 24 ou 48 poços. Gráficos gerados usando BioRender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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Neste artigo, descrevemos um protocolo simplificado para o isolamento e cultura do epitélio pigmentar da retina murina. As células RPE isoladas dos olhos de camundongos adultos expressaram um marcador específico de RPE, RPE65, e um marcador de junção intercelular, ZO-1. Além disso, as células cultivadas se desenvolveram em folhas hexagonais pigmentadas em cultura.

Vários métodos para isolamento de EPR em roedores foram publicados anteriormente 6,7,8,9,10,11,12. Muitos protocolos descascam as camadas de EPR da membrana de Bruch, exigindo habilidade técnica e aumentando o risco de danos ao EPR ou morte celular 6,7,9,11,12,16. Assim, este protocolo utiliza o descolamento enzimático da camada de EPR, em vez da dissociação mecânica, para promover a sobrevivência e manter a integridade das folhas de EPR em cultura. Este método produz RPE de camundongo em uma cultura que mantém a morfologia do RPE com células altamente pigmentadas e hexagonais que conservam a expressão de proteínas de junção apertada. Além disso, este protocolo carece do uso de reagentes complexos ou materiais usados em outros protocolos, como inserções de membrana permeável, proteínas adicionais de revestimento de matriz extracelular ou reagentes especializados de dissociação de tecidos. Em vez disso, este protocolo utiliza digestão enzimática simples usando tripsina-EDTA a 0,25% em combinação com agitação tecidual para dissociar a camada de EPR da membrana de Bruch. Este protocolo foi realizado com sucesso em camundongos de 3 a 14 semanas de idade; no entanto, mais olhos podem ser necessários para obter com sucesso uma cultura confluente em camundongos jovens.

Vários desafios podem surgir durante a execução deste protocolo. É necessária habilidade técnica para cortar com precisão a ora serrata e remover cuidadosamente a retina sem interromper a camada de EPR. A retina pode ser perturbada durante o corte da circunferência da esclera, o que pode alterar a viabilidade do EPR. O refinamento dessa técnica só pode ser realizado por meio da prática repetitiva e contínua. Além disso, as folhas de EPR podem permanecer presas à camada retiniana após a remoção. Para evitar perda excessiva de EPR, estimule o descolamento de retina usando uma seringa ou pipeta de transferência cheia de meio tampão de lavagem para levantar suavemente as bordas da retina da ocular. A incubação da hialuronidase também pode facilitar o descolamento16. Caso os EPR não estejam se desprendendo adequadamente da membrana de Bruch e da coroide, aumente o tempo de incubação com tripsina no banho-maria. Além disso, congele alíquotas de tripsina fresca a -20 °C e descongele diretamente antes de usar para manter a atividade enzimática ideal. A falha do EPR em se ligar à placa do poço após o isolamento pode surgir se as células forem semeadas em uma densidade muito baixa ou se o EPR for danificado durante o processo de isolamento. Além disso, nosso protocolo não requer o revestimento de proteínas da matriz extracelular (MEC) para cultura. No entanto, as proteínas da MEC, como fibronectina, colágeno IV, laminina ou colágeno I, demonstraram aumentar a ligação celular e devem ser consideradas se a adesão for baixa11.

Para aumentar o rendimento das monocamadas cultivadas com EPR, agrupe pelo menos 2-3 olhos de camundongos com a mesma base genética; As células podem perder sua forma hexagonal e pigmento ao longo do tempo se não forem semeadas em uma densidade alta o suficiente. Para camundongos com mais de 8 semanas de idade, 2 olhos por placa de 24 poços devem ser suficientes para uma confluência ideal. Se os camundongos tiverem menos de 8 semanas de idade, 3-4 olhos resultarão em melhor adesão e confluência. Com o tempo, as células podem ser suscetíveis à transição epitelial-mesenquimal (EMT) com perda de pigmentação e aquisição de uma forma alongada. A adição de inibidores de Rho-Quinase e TGFβR-1/ALK5, como Y27632 e Repsox, respectivamente, pode prevenir a EMT das células RPE cultivadas12. Embora o protocolo de isolamento seja breve, exigindo apenas 1 h para isolamento de 2-4 olhos, a cultura primária pode levar até 7-10 dias para atingir a confluência total. Além disso, a passagem do EPR é limitada, com um risco aumentado de EMT em cada passagem subsequente.

As células epiteliais pigmentares da retina são células críticas para manter a homeostase no olho. Os RPE atuam como fagócitos para auxiliar na manutenção dos fotorreceptores, evitar que as camadas neurais sofram danos causados pela luz e atuar como uma barreira epitelial apertada para regular o transporte17. Doenças que afetam diretamente o EPR, como degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa e retinopatia diabética, podem exacerbar a inflamação, aumentar a apoptose e interromper as junções celulares, levando ao aumento da probabilidade de degeneração retiniana e cegueira17. O cultivo de EPR primário facilita o estudo da patogênese das doenças oculares que afetam o EPR. Em conclusão, nosso protocolo encurta a duração do isolamento e simplifica as técnicas e reagentes necessários, mantendo a cultura de células de alta pureza.

Divulgações

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Não há divulgações financeiras ou não financeiras relevantes.

Agradecimentos

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A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (CSS), NIH Grant F31EY035156 (AH) e P30 EY011373. A organização financiadora não teve nenhum papel no desenho ou condução desta pesquisa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,009 RD Lâminas de borda únicaPersonna941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning10-013-CVcom 4,5 g/L de glicose, L-glutamina, piruvato de sódio
Soro bovino fetalCorning35010CV
GlutaMAX, 100xGibco35050061
Hank's Balanced Salt SolutionGibco14175095sem cálcio, sem magnésio, sem solução tampão HEPES vermelho de fenol
(1M)Gibco15630106
MEM Aminoácidos não essenciais, 100xGibco11140050
Faca Micro-UnitomeBVI Beaver377546
Solução de Penicilina-Estreptomicina, 100xMicroplacas30-002-CI
Falcon08-772-124 ou 48 Poços
Corning35-010-CV
Tripsina-EDTA (0,25%)Gibco25200056com tesoura vermelha de fenol
VannasFerramentas de Belas Ciências10091-12
de Poliestireno Corning Soro Fetal Bovino Regular de ,

Referências

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