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Articles by Alberto Bartesaghi in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Determinazione di strutture molecolari di glicoproteine dell'HIV Busta con Cryo-Electron Positron e automatizzato Sub-tomogramma Averaging
1Laboratory of Cell Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2The Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, 3National Library of Medicine, National Institutes of Health, 4Massachusetts Institute of Technology, 5William Fremd High School, 6University of Virginia, 7Duke University, 8Yale University, 9University of Notre Dame, 10Washington University in St. Louis, 11Bioinformatics and Computational Biosciences Branch, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 12Thomas Jefferson High School for Science and Technology
Il protocollo descrive un approccio high-throughput per determinare le strutture di proteine di membrana con crio-elettroni tomografia ed elaborazione delle immagini 3D. Esso copre i dettagli della preparazione dei campioni, raccolta, elaborazione e interpretazione dei dati, e si conclude con la produzione di un bersaglio rappresentante per l'approccio, l'HIV-1 glicoproteina Busta. Queste procedure di calcolo sono stati progettati in un modo che consente ai ricercatori e agli studenti di lavorare in remoto e contribuire alla elaborazione dei dati e l'analisi strutturale.
Other articles by Alberto Bartesaghi on PubMed
Un Approccio Basato Su Energia Tridimensionale Segmentazione Per L'interpretazione Quantitativa Dell'elettrone Tomograms
Tomografia elettrone permette la determinazione delle strutture tridimensionali di cellule e tessuti a risoluzioni significativamente superiore a quello che è possibile con microscopia ottica. Elettrone tomograms contengono, in linea di principio, grandi quantità di informazioni sui luoghi e le architetture di un gran numero di assembly sottocellulare e organelli. Lo sviluppo di approcci quantitativi affidabili per l'analisi delle caratteristiche di tomograms è un problema importante e una prospettiva difficile dovuto i rapporti segnale-rumore bassi che sono inerenti a immagini microscopiche biologiche elettrone. Questo è, in parte, una conseguenza della complessità tremenda di campioni biologici. Abbiamo rapporto su un nuovo metodo per la segmentazione automatica di particelle di HIV e selezionato compartimenti cellulari in elettrone tomograms registrato da sezioni fisse, incorporati in plastica derivate da macrofagi umani infettati da HIV. Caratteristiche individuali nel tomogramma sono segmentate utilizzando un algoritmo robusto romanzo che rileva i loro confini superfici minime come globale in uno spazio metrico definito da caratteristiche dell'immagine. L'ottimizzazione viene eseguita in un dominio trasformato sferico con al centro un punto interno della particella di interesse, fornendo una corretta impostazione per la minimizzazione veloce e accurata dell'energia segmentazione. Questo metodo fornisce strumenti per la rilevazione semi-automatizzate e valutazione statistica delle particelle di HIV nelle diverse fasi di assemblaggio nelle cellule e presenta le opportunità per la correlazione con i marcatori biochimici dell'infezione da HIV. L'algoritmo di segmentazione sviluppato qui costituisce la base dell'analisi automatizzata di elettrone tomograms e sarà particolarmente utile dato il rapido aumento del tasso di acquisizione dati. Potrebbero anche attivare studi di più grandi insiemi di dati, come quelli che potrebbero essere ottenuti dall'analisi tomografica delle cellule HIV-infettate da studi di grandi popolazioni.
Tomografia Elettrone Del Contatto Tra Cellule T E SIV/HIV-1: Implicazioni Per L'entrata Virale
Le glicoproteine busta del primate lentiviruses, compresi i virus dell'immunodeficienza umana e scimmiesca (HIV e SIV), sono eterodimeri di una glicoproteina transmembrana (solitamente gp41) e una superficie glicoproteina (gp120), che si lega CD4 su cellule bersaglio di avviare entrata virale. Abbiamo usato la tomografia elettrone per determinare le architetture tridimensionale dei virions SIV purificato in isolamento e a contatto con cellule bersaglio CD4 +. Le punte di superficie glicoproteina trimeric busta virale sono eterogenee in aspetto e in genere circa 120 A lungo e circa 120 A largo all'estremità distale. Aggancio della SIV o HIV-1 sulla superficie delle cellule T si verifica attraverso una regione di contatto a forma di collo che è di circa 400 A vasta e costantemente si compone di un cluster ravvicinato di cinque a sette caratteristiche a forma di bastoncello, ciascuno circa 100 A lungo e circa 100 A livello. Questa struttura distintiva non è osservata quando i virus vengono incubati con linfociti T in presenza di anticorpi anti-CD4, l'antagonista del CCR5 TAK779 o con l'inibitore di entrata del peptide SIVmac251 C34. Per virioni associati alle cellule, paio trimeri sono state osservate lontano da questo cluster all'interfaccia virione-cella, anche nei casi in cui sono state utilizzate preparazioni di virus mostrando come 70 trimeri di glicoproteina busta per particella virale. Questa zona di contatto, che noi termine l'artiglio"entrata", fornisce un contesto spaziale per capire i meccanismi molecolari di entrata virale. Determinazione della composizione molecolare e struttura dell'artiglio voce può facilitare l'identificazione dei farmaci migliorate per l'inibizione dell'entrata HIV-1.
Tomografia Di Elettrone Di Virus
Le architetture molecolari del virus avvolto e complessa la comprensione è una frontiera stimolante in biologia strutturale. In questi virus, la variazione strutturale e compositiva, da una particella virale a altro generalmente preclude l'uso di cristallizzazione o di immagine media delle procedure che sono state attuate con successo in passato per i virus altamente simmetrica. Mentre i progressi nella tomografia elettrone cryo di esemplari non marcate forniscono nuove opportunità per l'identificazione e molecolare con una media di singoli sottocomponenti come le punte di superficie glicoproteina su virus purificato, tomografia elettrone delle cellule colorate e tuffo-congelato viene utilizzata per visualizzare il contesto cellulare di entrata virale e replica. Qui, passiamo in rassegna gli sviluppi recenti in entrambe le aree si riferiscono alla nostra comprensione della biologia dell'eterogeneo e pleiomorphic virus.
Architettura Molecolare Del Nativi Dell'HIV-1 Gp120 Trimeri
Le glicoproteine busta (Env) del virus dell'immunodeficienza umana e scimmiesca (HIV e SIV, rispettivamente) mediare associazione virus al recettore superficiale delle cellule CD4 su cellule bersaglio per avviare l'infezione. Env è un eterodimero di una glicoproteina transmembrana (gp41), una glicoproteina di superficie (gp120) e trimeri forme sulla superficie della membrana virale. Utilizzando la tomografia cryo-elettrone combinata con classificazione di immagine tridimensionale e una media, si riportano che le strutture tridimensionali di Env trimeric visualizzati su HIV-1 nativo dello stato unliganded, nel complesso con la b12 anticorpo neutralizzante ampiamente e in un complesso ternario con CD4 e l'anticorpo 17b. Montando le strutture di cristallo conosciuto del nucleo nella vitamina b12 - e CD4/17b-bound conformazioni nelle mappe di densità derivate dalla tomografia elettrone gp120 monomerico, deriviamo modelli molecolari per l'HIV-1 gp120 trimero nativo in unliganded e Stati associati a CD4. Dimostriamo che CD4 associazione si traduce in un'importante riorganizzazione del trimero Env, causando una rotazione verso l'esterno e lo spostamento di ogni monomero gp120. Questo sembra essere accoppiato con un riarrangiamento della regione gp41 lungo l'asse centrale del trimero, portando a più vicino contatto tra le membrane delle cellule bersaglio e virali. I nostri risultati delucidare la struttura e i cambiamenti conformazionali di trimeric HIV-1 gp120 pertinenti alla neutralizzazione dell'anticorpo e l'attaccamento alle cellule bersaglio.
Determinazione Della Struttura Di Membrana Della Proteina Mediante Tomografia Cryo-elettrone E Una Media Di Immagini 3D
La stragrande maggioranza dei complessi della proteina di membrana di interesse biologico non può essere purificata per omogeneità, o rimosso da un contesto fisiologicamente rilevante senza perdita di funzione. Pertanto, non è possibile determinare facilmente le strutture 3D di questi complessi di proteine utilizzando la cristallografia a raggi x o crio-microscopia convenzionale. Appena emergenti metodi che combinano la tomografia cryo-elettrone con classificazione di immagini 3D e una media, tuttavia, cominciano a fornire opportunità uniche per la determinazione in situ delle strutture della membrana assembly della proteina nelle cellule intatte e il virus. Qui si rassegna recenti progressi in questo campo e valutare il potenziale di questi metodi per descrivere la conformazione delle proteine di membrana nel loro ambiente nativo.
Architetture Molecolari Di Glicoproteine Busta Trimeric SIV E HIV-1 Su Virus Intatto: Ceppo-dipendente Dalla Variazione Nella Struttura Quaternaria
Il passo iniziale per infezione delle cellule bersaglio da umani e il virus dell'immunodeficienza delle scimmie strettamente correlate (HIV e SIV, rispettivamente) si verifica con l'associazione di glicoproteine busta trimeric (Env), composto da eterodimeri della glicoproteina transmembrana virale (gp41) e superficie glicoproteina (gp120) a bersaglio le cellule T. Conoscenza della struttura molecolare di Env trimeric su virus intatto è importante per comprendere i meccanismi molecolari sottostanti le interazioni virus-cellula e per la progettazione di vaccini basati su immunogen efficaci combattere l'HIV/AIDS. Analisi precedenti di virioni di HIV-1 BaL intatte già hanno portato a strutture di Env trimeric in unliganded e CD4-liganded afferma a risoluzione Å ~ 20. Qui, ci mostra che le architetture molecolari di Env trimeric da SIVmneE11S, SIVmac239 e l'HIV-1 R3A ceppi sono strettamente paragonabili a quella determinata in precedenza per BaL di HIV-1, con la V1 e V2 cicli variabile si trovano all'apice del picco, vicino alla zona di contatto tra virus e cellula. La posizione delle anse V1/V2 in Env trimeric fu definitivamente confermata dall'analisi strutturale dei virioni di HIV-1 R3A ingegnerizzato di Env espressa con eliminazione di questi cicli. Sorprendentemente, in SIV CP-MAC, un ceppo di CD4-indipendente, Env trimeric è in una conformazione costitutivamente "aperta" con gp120 trimeri strombate in una conformazione simile a quello visto per Env di HIV-1 BaL quando è complessato con sCD4 e il CD4i anticorpo 17b. I nostri risultati suggeriscono una spiegazione strutturale per il meccanismo molecolare di entrata virale CD4-indipendente e ulteriormente stabilire che tomografia del cryo-elettrone può essere utilizzata per scoprire distinte, funzionalmente rilevanti strutture quaternarie di Env visualizzati su virus intatto.
Trimeric HIV-1 Glicoproteina Gp140 Immunogeni E Nativo Dell'HIV-1 Busta Glicoproteine Visualizza Lo Stesso Chiuso E Aperto Quaternarie Architetture Molecolari
Il primo passo nell'infezione da HIV-1 si verifica con l'associazione di superficie delle cellule CD4 a trimeric delle glicoproteine busta HIV-1 (Env), un eterodimero di una glicoproteina transmembrana (gp41) e una superficie glicoproteina (gp120). Il design delle versioni solubili di Env trimeric che visualizzano le proprietà strutturali e funzionali simili a quelli osservati sul virus intatto è altamente auspicabile dal punto di vista della progettazione immunogeni che potrebbero essere efficace come i vaccini contro l'HIV/AIDS. Mediante tomografia cryoelectron combinata con subvolume media, abbiamo analizzato la struttura dei trimeri gp140 SOSIP, che sono scissi, solubilizzato versioni del ectodomain di trimeric Env di HIV-1. Mostriamo che unliganded gp140 trimeri adottano una disposizione quaternaria simile a quello visualizzato dal nativo unliganded trimeri sulla superficie dei virioni di HIV-1 intatti. Quando complessato con CD4 solubile, 17b Fab, che associa alla gp120 al suo sito di legame delle chemochine coreceptor, o sia solubile CD4 e 17b Fab, trimeri gp140 visualizzano una conformazione aperta in cui c'è una rotazione verso l'esterno e lo spostamento di ogni protomer gp120. Dimostriamo che il regime molecolare di gp120 trimeri nelle conformazioni aperte e chiuse di trimero solubile sono le stesse di quelle osservate per gli stati aperti e chiusi, rispettivamente, di gp120 trimeric su intatti virioni di HIV-1 BaL, stabilendo che trimeri gp140 solubile possono essere progettati per imitare le transizioni strutturali quaternarie visualizzati dal nativo trimeric Env.
Strutture Tridimensionali Degli Stati Associati a CD4 Solubili Di Glicoproteine Di Busta Del Virus Dell'immunodeficienza Delle Scimmie Trimeric Determinate Mediante Tomografia Computerizzata Cryo-elettrone
Le punte di glicoproteina (Env) trimeric busta visualizzate sulla superficie del virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV) e virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) virioni sono composte da tre eterodimeri di glicoproteine virali gp120 e gp41. Anche se il legame di gp120 di cellule CD4 superficiale e un recettore delle chemochine è noto per provocare alterazioni conformazionali gp120 e gp41, cambiamenti nella struttura quaternaria di trimero solo di recente sono state chiarite. Per isolare il BaL di HIV-1, CD4 attaccamento provoca un riarrangiamento colpisce il trimero da un "chiuso" ad una conformazione "aperta". L'effetto di CD4 su trimeri SIV, tuttavia, non è stata descritta. Utilizzando la tomografia cryo-elettrone, ora abbiamo determinato architetture molecolari del CD4 solubile (sCD4)-Stati di SIV Env trimeri per tre diversi ceppi (SIVmneE11S, SIVmac239 e SIV CP-MAC) legati. In netto contrasto con l'HIV-1 BaL, SIVmneE11S e SIVmac239 Env ha mostrato solo lievi cambiamenti conformazionali seguendo sCD4 associazione. In SIV CP-MAC, dove Env trimeric Visualizza una conformazione costitutivamente "aperta" simile a quello visto per Env di HIV-1 BaL nello stato sCD4-complessato, ci mostra che non ci sono cambiamenti significativi ulteriori nella conformazione dell'associazione del sCD4 o 7 3 anticorpo. Le mappe di densità mostrano anche che gli anticorpi 3 7 e 17b target epitopi su gp120 che sono su lati opposti del sito Associazione coreceptor. Questi risultati forniscono nuove intuizioni della diversità strutturale di SIV Env e mostrano che ci sono dipendenti dal ceppo variazioni nell'orientamento di sCD4 associato a trimeric SIV Env.
Separazione Computazionale Di Eterogeneità Conformazionale Mediante Tomografia Cryo-elettrone E Sub-volume 3D in Media
In precedenza abbiamo usato tomografia cryo-elettrone, combinata con una media di sub-volume e classificazione per ottenere strutture 3D delle assemblee macromolecolare in casi dove era presente una sola specie dominante e applicato questi metodi per l'analisi di una varietà di trimeric HIV-1 e SIV busta glicoproteine (Env). Qui, noi estendere questi studi dimostrando automatizzati, iterativi, manca di metodi di allineamento e classificazione Cuneo-correzione immagine 3D per distinguere molteplici conformazioni che sono presenti contemporaneamente. Vi presentiamo un metodo per misurare la distribuzione spaziale degli elementi vettoriali che rappresentano stati conformazionali distinti di Env. Noi identificare strategie di elaborazione dei dati che permettono di chiare separazione di precedentemente caratterizzato chiuso e aprire conformazioni, come pure unliganded e anticorpo-liganded stati di Env quando sono presentano in miscele. Mostriamo identificazione e rimozione di picchi con il più basso rapporto segnale-rumore migliora l'accuratezza complessiva di allineamento tra i singoli sub-volumi Env, che tale precisione di allineamento, a sua volta, determina il successo di classificazione di immagine nel valutare conformazionali eterogeneità nei miscugli eterogenei. Noi convalidare queste procedure per separazione computazionale con successo separando e ricostruendo distinte strutture 3D per unliganded e anticorpo-liganded, come pure le conformazioni aperte e chiuse di Env presenti simultaneamente in miscele.
