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Articles by Iain A. Drummond in JoVE
JoVE General
急性腎障害を研究するためにゼブラフィッシュ幼生の静脈内Microinjections
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh, 3Department of Medicine and Genetics, Harvard Medical School
我々は2日後fetilization（DPF）急性腎障害（AKI）を誘導するためにゼブラフィッシュの幼虫にアミノグリコシド、ゲンタマイシンを、マイクロインジェクションのテクニックを説明します。我々はまた、AKIの媒介の損傷を可視化するためにゼブラフィッシュ幼生の埋め込みプラスチックと切片全体のマウント免疫組織化学のための方法を、説明します。
Other articles by Iain A. Drummond on PubMed
内皮腎形態形成におけるシグナル伝達: 血行動態の部隊のための役割。
血管内皮細胞のローカル存在はいくつかの臓器の適切な胚発生のために必要なようです。しかし、関与の信号は知られています。糸球体ポドサイト食い込んだ毛細血管の周りの合体によって生成され、血液限外ろ過のサイトです。血管の不在では、糸球体アセンブリは発生しません。Glomerulogenesis を防ぐため、ゼブラフィッシュの変異を説明します。すべての変異体の心機能障害を表示します。薬理学的干渉心拍出量と焦点レーザー血管の閉塞を同様に糸球体の形成を防ぐ。これらのすべての摂動の統一機能は血流の不在です。私たちを見つけストレッチ応答性の高い方法では、規制する他のシステムで知られている式マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ-2 (MMP-2) の腎血管内皮細胞では、フローによって規制されています MMP 2 感受性イベント関連のフロー シグナルの下流にある可能性を示唆します。これを支持する封鎖によってチンプ 2 注入 MMP 2 活動の循環をかき乱すかないが糸球体アセンブリを防ぎます。したがって、血管の流れは最もおそらく、ストレッチ応答のシグナル伝達系の血管壁を介して作用する糸球体のアセンブリが必要です。
新規 Nek 家族キナーゼの欠陥はマウスやゼブラフィッシュ嚢胞性腎疾患が発生します。
マウス常染色体劣性若年性嚢胞腎 (jck) 変異性嚢胞腎疾患の結果します。我々 は突然変異の Nek8、小説 Nek キナーゼ家族の非常に節約されたメンバー jck マウスで識別しています。体外式で変異した Nek8 結果の拡大、多核細胞が異常なアクチン細胞骨格と。Nek8 遺伝子の欠陥嚢胞性疾患を引き起こすことを確認するには、我々 にクロス種の分析を実行: Nek8 のオーソログに対応する morpholino アンチセンス オリゴヌクレオチド ゼブラフィッシュ胚の注入における嚢胞の形成で起因しました。これらの結果は、遺伝子機能の異なるモデル系の比較解析注釈遺伝子機能の強力な手段を表すことを示しています。
一次繊毛と左右軸決定の関数に腎嚢胞性疾患のリンクInversin原因ネフロン癆、タイプ2のエンコードINVSの変異、
ネフロン癆（NPHP）、常染色体劣性嚢胞腎疾患は、小児の慢性腎不全につながります。 NPHP1とNPHP4で変異遺伝子が同定されており、乳児ネフロン癆（NPHP2）に関連付けられている遺伝子座がマッピングされていました。 NPHP2の腎臓表現型は、NPHPと多発性嚢胞腎（PKD）の臨床的特徴を兼ね備えています。ここでは、内臓逆位ととせずにNPHP2で変異遺伝子としてinversin（INVS）を識別します。我々はnephrocystin、β-チューブリン、一次繊毛の主成分でnephrocystinのNPHP1との相互作用で変異遺伝子の産物でinversinの分子相互作用を示しています。我々はnephrocystin、inversinおよびβ-チューブリンは腎尿細管細胞の一次繊毛に局在することを示す。さらに、我々はゼブラフィッシュのinvs発現のノックダウンによってループの心のPKDのような腎嚢胞性表現型とランダム化を生成します。 inversin、nephrocystinおよびβ-チューブリンの繊毛の相互作用と共局在化は一次繊毛機能にと左右軸の決定に、PKDにNPHPの病原性の側面を接続します。
腎臓の発達や疾病、ゼブラフィッシュで。
ひと疾患の分子病態の解明、少なくとも、人間の実験を一般的には眉をひそめることです多くの実験の課題を提示します。ゼブラフィッシュを含むモデル生物は遺伝子機能の実験的解析と疾患プロセスの詳細な評価を許可します。ゼブラフィッシュは今ではターゲットを絞った「ノックダウン」と公平な突然変異誘発アプローチための遺伝的ツール手にいる脊椎動物のモデル生物として成熟しています。魚の幼虫の切り口でひと腎臓開発や病気の多くの側面を追求する関連する腎臓です。この短いレビューでは、ゼブラフィッシュ切り口が人間の健康と開発の問題に適用する最近の進歩について概説します。
繊毛駆動型流体の流れのゼブラフィッシュ切り口、脳クッパーの小胞の正常の器官形成が必要です。
繊毛は、運動と感覚器官として含む嚢胞性腎疾患、水頭症と内臓逆位症と同様に通常の開発に関与しています。腎臓上皮の繊毛] マウス ノード間で、集団、運動性と非運動性内臓を規制する提案されている 2 つの繊毛の非運動性の感覚器官に提案されています。我々 ゼブラフィッシュ幼虫腎臓、脊髄およびクッパーの小胞内繊毛運動、いる流体の流れ、これらの器官のそれぞれの共通機能であることを示唆. します。混乱の繊毛の構造や運動における嚢胞形成, 水頭症と左右非対称の欠陥で結果。データ損失流体の流れのオルガン膨病態、腎臓と脳の考慮することができます流体の蓄積につながることを示します。クッパーの小胞内流の損失の内臓を生成 '節フロー' メカニズム非哺乳類の脊椎動物で節約されることを示す、左から右のパターン形成の損失に関連付けられています。
Roundabout4 は血管新生をインビボ不可欠です。
血管および神経細胞ネットワークのステレオタイプ的なパターンは、特定の遺伝的プログラムはしっかりとパスの定量とその結果、血管新生および軸索ガイダンス機構を制御をお勧めします。我々 の研究は伝統的に正中線からの反発を仲介する受容体は、ロータリー家族のひとりを当てください。ここでは、我々 はこの家族は、roundabout4 の第 4 メンバーを特徴付ける (robo4)、ゼブラフィッシュ胚の血管系で表明した優勢なロータリー （ロボ） であります。遺伝子ノックダウンと過剰発現のアプローチは、その robo4 協調対称およびディレクテッド intersomitic 船の発芽のため不可欠であり、このプロセスに機械的な洞察力を提供する表示します。また、ヒト robo4 遺伝子は機能的の進化的保全を示唆、robo4 遺伝子の機能の損失を補償します。この記事に内皮固有関数脊椎動物の in vivo におけるロボ遺伝子を報告します。
ゼブラフィッシュSlc4a2/ae2アニオン交換：cDNAクローニング、マッピング、機能解析、およびローカライゼーション
ゼブラフィッシュは前腎、腎臓の開発の研究のためにますます使用されてきましたが、腎臓のイオントランスポーターとゼブラフィッシュのチャネルの研究がいくつか残っています。我々はゼブラフィッシュの腎臓、slc4a2/ae2からAE2陰イオン交換体のオルソログのcDNAクローニングと特性を報告します。リンケージグループ2のAE2遺伝子は1228 aaはマウスAE2aで64％AAのアイデンティティを示すポリペプチドをコードしている。ゼブラフィッシュAE2遺伝子のエクソン - イントロンの境界は、齧歯類とヒトの遺伝子のものとほぼ同じです。 in situハイブリダイゼーションホールマウント後に前腎原基と、それが72時間postfertilization（HPF）を介して続く成形前腎管、で、その後5体節段階には早くも将来の脳でAE2 mRNAを検出します。ゼブラフィッシュAE2は、アフリカツメガエル卵母細胞を仲介するのNa（+）で表され、独立した、電気的中性の（36）CL（ - ）/ CL（ - ）DIDSによる阻害に対して適度に敏感な交換は、酸性の細胞内のpHによって、酸性細胞外pHによって阻害したが、活性化され（酸性）アンモニウムによっておよび高浸透圧によって。ゼブラフィッシュもAE2仲介のCl（ - ）/ HCO（3）（ - ）の交換をアフリカツメガエル卵母細胞およびトランスフェクトしたHEK-293細胞における細胞膜の中や近くに蓄積する。 24から48 HPFゼブラフィッシュの胚では、AE2ポリペプチドの独占的な支配ではなくローカライズは前腎管上皮細胞の頂膜である。したがって、AE2は、機能、メカニズム、急性規制でその哺乳類オルソログに似ているが、腎臓での優先的に心尖部式で異なります。これらの結果は、ゼブラフィッシュ腎臓の発達と機能にAE2の役割のテストを通知します。
ゼブラフィッシュにおけるろ過装置の組織ではネフリン、Podocin FERM ドメイン蛋白質モザイク目が必要です。
足細胞血液ろ過バリア形成腎糸球体の腎臓の専門の細胞であります。ポドサイトのバリア機能糸球体血管を取り巻くポドサイト足プロセス間を形成スリット ダイヤフラムと呼ばれる特殊な細胞接着錯体の開発によって異なります。フォームにスリット横隔膜の高分子量蛋白質の漏れの濾液を血液と尿、尿蛋白と呼ばれる状態に発生します。ゼブラフィッシュ切り口アッセイ法としては、糸球体機能の開発スリット膜の識別の新規コンポーネントの目的のため使用することができるかどうかこの作品では、我々 はテストします。我々 はまずネフリン、フィンランドの種類、および Podocin、常染色体劣性ステロイド抵抗性ネフローゼ症候群の変異遺伝子の先天性ネフローゼ症候群に関連付けられている疾患遺伝子のゼブラフィッシュ相同の機能特徴。ゼブラフィッシュ ネフリンと podocin いた具体的表現における糸とにおけるポドサイト セル構造の開発に必要な。電顕的に, ネフリンまたは podocin 式の中断スリット-ダイヤフラム 72 および 96 h post-fertilization と障害の損失にフォーム通常ポドサイト足プロセスの結果。またバンド 4.1/FERM ドメイン遺伝子モザイク目足細胞での発現がスリット膜細胞の適切な形成が必要であることを見つけます。機能的なアッセイの糸球体ろ過バリアがない通常ネフリン、podocin またはモザイク目式結果糸球体濾過差別の損失での高分子量物質の異常な通路糸球体の濾液に明らかにしました。
Polycystin 2 タバコプロトプ、ゼブラフィッシュの関数。
Polycystin 2 関数は陽イオン透過性過渡受容体潜在的なイオン チャネル腎臓上皮細胞と変異時として人間常染色体優性多発嚢胞腎疾患の結果します。探査 Polycystin 2 の生体内機能の発現と機能ゼブラフィッシュ胚発生中に検討しました。pkd2 mRNA は普遍的に表現されると隔離された pronephroi 上の逆転写を pcr 法による幼虫の腎臓でのプレゼンスを確認できませんできます。アンチ ゼブラフィッシュ Polycystin 2 抗体を用いた免疫染色では運動性腎上皮細胞繊毛、細胞膜の細胞内の蛋白質の表現を明らかにしました。細胞内局在特定セグメントだった;尾側におけるセグメントでは、Polycystin 2, また細胞質小胞に集中していたに対し近位ネフロン セグメントでは、Polycystin 2 基底細胞膜に限局していた。Polycystin 2 はまた筋肉細胞と細胞の耳、側線器官および嗅覚プラコードを含むメカノトランスダクションと関連付けられている感覚細胞の様々 な表現しました。Polycystin 2 mRNA 発現の破壊における腎嚢胞体軸曲率、オルガン ラテラリティ欠陥、人間の PKD2 mRNA の発現によって救出される可能性水頭症欠陥で結果。フレーム欠落最初の細胞外ループと C 末端 phosphofurin 酸性クラスター タンパク質 1 （PACS-1) 結合部位 Polycystin 2 サッカード頂端細胞表面に引き起こされる細胞質テールの並べ替え。ゼブラフィッシュ鞭毛内輸送蛋白質 (IFT) 変異体とは異なり、嚢胞形成しない繊毛の欠陥に関連付けられているし、代わりに相関出力、削減腎臓流体と尾側ダクト頂端細胞膜の拡張と尾側におけるネフロン セグメントの閉塞。
動的な式複数発展途上の臓器ゼブラフィッシュの Osmosensory チャネル Trpv4 の。
過渡受容体潜在的なチャネルは、組織の広いスペクトルの機能し、感覚刺激を伝達します。バニロイド （カプサイシン） チャネル TRPV4 は浸透圧の変化に敏感で、様々 な生物における浸透圧調節応答の中心的な役割を果たしています。ゼブラフィッシュ trpv4 cDNA のクローンを作成し、その式胚形成過程における試金されます。trpv4 4 細胞期胚における母性 mRNA として表現され、後でココヤシ式最初成形脊索で 1 つの体節の段階で観察されます。脊索式が続く 24 に脳内の広範な表現を観察すると hpf。32 の hpf trpv4 で式は主に心室内皮を制限されて、心内膜で観察されます。Trpv4 の低レベルの式は、32-48 hpf 最強式最も遠位ネフロン セグメントと排泄腔を持つにおける腎臓内からも見られます。式、また 32 で開始側線器官の観察, hpf 有毛細胞で主に。72, Hpf trpv4 心臓、腎臓、脳、および側線器官での表現が続く式、脊索でダウン規制中です。
脊椎動物の Rho グアニン ヌクレオチド交換のための新しい関数は、繊毛上皮の要因します。
人間 ARHGEF11、PDZ ドメインを含む Rho グアニンヌクレオチド交換因子 (RhoGEF) は、活性の Galpha12/13 またはプレキシン B1 によって組織培養、どこそれ変形の能力を展示を関連付けますとアクチン細胞骨格の調節、神経突起の伸長を制御する、Rho の活性化に刺激応答を仲介する主に研究されています。フルーツ フライの相同物、RhoGEF2、Rho、微小管、関連付けを有効にするには、ヘテロ三量体 G 蛋白質の亜単位対話し、原腸陥入上皮の折り畳みを仲介する細胞形状の変化の中が必要です。ここでは、遍在胞胚および原腸胚期で表現されていると神経組織と、切り口の後胚発生中に濃縮されて ARHGEF11 のゼブラフィッシュ相同の機能的特性を報告します。胚における過剰発現ゼブラフィッシュまたは人間蛋白質の原腸陥入運動障害に対しその人間の相同物と同様、ゼブラフィッシュ Arhgef11 培養細胞のアクチン ストレス繊維形成刺激。Arhgef11 軌跡と翻訳またはスプライシングのいずれかをブロックするように設計されて morpholino のアンチセンス オリゴヌクレオチドを包含する染色体の削除機能喪失実験胚の腹側湾曲の軸を持つと他の表現型の数繊毛上皮と関連付けられています。しばしば展示 Arhgef11 欠損胚の過剰数追い回し耳小胞腎嚢胞、拡大脳室ラテラリティ マーカーの発現変化。繊毛形成し、これらの胎児の運動だったが、F アクチンと Na (+) の分布を偏光/K (+)-atpase 活性におけるダクトに乱されました。ゼブラフィッシュ胚における母親の私たちの研究は新しい、この RhoGEF 繊毛上皮脊椎動物の開発時の重要な役割を同定しました。
Notch シグナル輸送上皮 Multiciliated 細胞ゼブラフィッシュ切り口の分化を制御します。
上皮細管臓器機能の特定の側面を専門にする複数のセルの種類で構成されます。ゼブラフィッシュ切り口で multiciliated 細胞 (MCCs) 流体の推進のために, 上皮細胞回復フィルター処理血液溶質輸送に対しに特化されます。これらのセルの種類が分布する a; ごま塩 ' 側抑制機構はその分化の役割を果たすことを示唆、切り口のファッション。ギザギザ 2 MCCs とその notch3 で表される切欠きリガンドにおける上皮細胞の表現を見つけます。Morpholino ノックダウンのいずれかの 2 または notch3、または心爆弾 （で損なわれるどの Notch) の突然変異をギザギザ、イオン輸送体の発現を示すにおけるセル transfated に MCCs。 逆には、Notch1a の細胞内ドメインの異所性発現 MCC 分化を抑制する失われたあるに対し ciliogenic 遺伝子発現を劇的に拡大します。映像を用いた γ-セクレターゼ阻害 MCC の分化のパターンが明らかである前に Notch シグナルにおける開発の初期段階のための要件を示した。驚くほど、我々 はギザギザ 2 見つけるノックダウン エキストラ繊毛を生成し、腎臓繊毛の二重変異のバブルを救助するのに十分です。ジャグ 2/Notch シグナル multiciliated 上皮細胞 rfx2、ゲノムス クリーニング プログラムの重要な転写調節の弾圧を含む遺伝経路の方法で切り口を輸送対の数を調節することが示唆されました。
ゼブラフィッシュ逃亡者遺伝子繊毛チューブリン ポリグルタミル化必須の調節因子をエンコードします。
繊毛と基底ボディ左右非対称、腎機能、脳脊髄液輸送世代の視細胞外節とヘッジホッグ シグナル伝達の開発を含む機能の広範なスペクトルの重要な器官です。ゼブラフィッシュ逃亡者 (flr) 変異株無作為の左右非対称性、水頭症、腎嚢胞、ロッドの外側セグメントの欠陥、繊毛の多面欠陥を示唆して展示します。位置識別 flr をクローニング、テトラトリコペプチド線虫線虫タンパク質繊毛細胞で高発現していた DYF1 に相同タンパク質を繰り返します。flr における繊毛いた短縮、削減のビートの振幅を示し、嗅繊毛欠席した変異体で。flr 繊毛微小管 B-細管, チューブリン修飾 （ポリグルタミル化またはポリグリシル化） を欠いている軸に類似の微細構造的欠陥を出展しました。flr 繊毛その flr 小説変調チューブリン ポリグルタミル化のエンコードを示す繊毛ポリグルタミン チューブリンの劇的な減少を示した。また線虫 flr ホモログ、dyf 1 は、また感覚神経細胞繊毛におけるチューブリン ポリグルタミル化が必要です.ゼブラフィッシュ チューブリン チューブリンポリグルタミラーゼ、Ttll6 のノックダウンは具体的に嗅覚プラコード、flr 変異体に類似のチューブリン ポリグルタミル化と繊毛形成を排除しました。これらの結果は、チューブリン ポリグルタミル化は脊椎動物の繊毛の運動性と構造のためが必要で、妥協すると、結果にゲノムス クリーニングが失敗した最初の in vivo 証拠です。
ゼブラフィッシュにおける TrpC1 と TrpC6 オルソログの発現
過渡受容体潜在的な (TRP) 遺伝子は様々 な生物や細胞型の陽イオン選択性イオン チャネル形成サブユニットをエンコードします。TRP チャネル熱、触覚、味覚、そして浸透は流体の流れを検出するセンシングに至るまで多様な機能を果たします。TRPC1 と TRPC6 メンバーはいくつかの細胞イベントのニューロンの樹状突起の安定化移行、平滑筋細胞の収縮反応および腎臓足細胞の構造の整合性の維持などに貢献すると考えられる TRPC 亜科に属する。病原性の役割は、喘息や慢性閉塞性肺疾患、TRPC1 を示唆されているし、TRPC6 機能障害は最近漏出腎臓病にリンクされていた。ゼブラフィッシュ臓器機能に TRPC チャネルの潜在的な役割を探索するには、ゼブラフィッシュの trpC1 と trpC6 の Cdna をクローン化し、ゼブラフィッシュの開発中に彼らの発現を調べた。我々 は trpC1 式頭、周囲の流出路、心臓の細胞と神経節細胞として核内層目の検出。trpC6 式は、頭、胸鰭、大動脈内皮細胞と消化管平滑筋細胞で検出されました。我々 の結果はゼブラフィッシュの開発中は、いくつかの組織における TRPC チャネルの役割をポイントし、ゼブラフィッシュに適したモデル系特定の細胞型で TRPC1 と TRPC6 の病態生理を研究することが示唆されました。
奇数のスキップ Related1 腎血管細胞運命対調節における内胚葉の小説の役割は、明らかにします。
腎臓および血管系密接、両方が機能的にリンクされている、開発、nephric ときおよび血液・血管中に前駆細胞ゼブラフィッシュとカエル胚における中胚葉の隣接するバンドを占めます。腎臓血液・血管系統対の分化の根底にある発達のメカニズムは不明のまま。奇数スキップ related1 (osr1) 遺伝子発現胚芽リング mesendoderm で、その後内胚葉と中間胚葉決定的な腎臓または血液・血管マーカーの発現前ですジンクフィンガー転写因子をエンコードします。ノックダウン osr1 ゼブラフィッシュ胚における母親の完了すると、特定のセグメント損失前方腎臓前駆細胞と同じトランク地域の angioblast 細胞数の代償性増加の結果。組織では、腎尿細管の後続不在、拡大カーディナル静脈および後頭静脈叢の拡大を明らかにしました。変更された腎血管の開発拡張内胚葉開発 osr1 ノックダウンで相関対。関数の複合 osr1 損失と sox32/カサノバのノックダウンによる内胚葉の封鎖前方腎臓開発を救出しました。Osr1 活動が mesendoderm から内胚葉分化を制限する必要があることが示唆されました。osr1 の不在では、過剰な内胚葉中胚葉分化, 血管の開発に向けて腎臓からバランスをシフトを変更します。
集団細胞遊走腎ネフロンの形態形成を駆動します。
上皮の臓器の組織開発中に細胞分化や形態形成細胞運動の結合プロセスによって実現されます。腎臓では、ネフロン機能の臓器単位です。各ネフロン特定のトランスポート機能を持つ個別のセグメントに分割する上皮の尿細管です。ほとんどはネフロン セグメントの定義方法またはセグメント彼ら独特の形態と細胞の形状を取得する方法について知られていません。成形ゼブラフィッシュにおけるネフロンのライブ、in vivo の細胞イメージングを使用して、我々 の移行は十分にネフロン セグメント境界の最終的な位置および特性の畳み込みの近位尿細管上皮細胞アカウントを区別が見つかりました。における細胞アドヘレンスジャンクションを維持し、ながら彼らは総称して移行頂ブラシ境界膜の偏光します。個々 の尿細管細胞は基底膜の突起の運動の方向を展示し、過渡、リン酸化の焦点接着キナーゼ陽性癒着基底膜を確立するために表示されます。細胞遊走その細胞分裂しないいないドライブの移行を示すカンプトテシン存在下で続けた。ネフロンの延長は、しかし、具体的に, ret1 陽性の最も遠位ネフロン セグメントの尿細管細胞数の増加によって同行しました。流体の流れ、切り口の発症を細胞遊走の開始と一致しました。完全封鎖における流体流動の細胞移動と近位ネフロン畳み込みを防止しました。近位、ろ過駆動の流体の流れの選択的封鎖は遠位尿細管畳み込みの位置をシフトし、繊毛駆動流動遠位ネフロン細胞の永続的な移行のための役割を明らかにしました。我々 はそのネフロン形成尿細管基底膜の範囲内で流体の流れに依存し、集団の上皮の細胞移行によって駆動される締結します。我々 の結果ネフロン関数と流体の流れと形態形成の間の親密なリンクを確立します。
クローン作成、ローカリゼーション、および、起電力型マイクロ Na + 重炭酸共 (NBCe1) ゼブラフィッシュからの機能的発現
無k Na の変異 c++/cli NBCe1 が酸塩基の恒常性と眼の流体輸送において重要な役割を示す人間を引き起こす深刻な近位腎尿細管性アシドーシス、緑内障、白内障 nHCO3 共 (NBCe1, SLC4A4)。恒常性の役割と個体発生タンパク質 NBCe1 をよりよく理解するには、我々、ローカライズ、クローンと downregulated ゼブラフィッシュでは、NBCe1 式とアフリカツメガエル卵母細胞に発現するときその輸送特性について検討しました。ゼブラフィッシュの NBCe1 （zNBCe1） 80% 公開された哺乳類 NBCe1 Cdna に同一です。他の魚のような NBCe1 クローン、ゼブラフィッシュの NBCe1 哺乳類 NBC (Slc4a4 B) の膵臓の形式に最も似ていますが、ゼブラフィッシュで見つけた支配的アイソ フォームに表示されます。胚の in situ ハイブリダイゼーション実証腎臓切り口と 24 h postfertilization (hpf) とギルで眼と脳 120 によって mRNA 発現 hpf。免疫組織化学的ラベリング式アダルト ゼブラフィッシュ目とギルで実証。Morpholino ノックダウン研究目と脳の発達の役割を実証し、変更された流体と電解質バランスを示す浮腫を引き起こした。膜電位 (Vm), 電圧クランプ (VC), 細胞内 pH を測定する電極の使用 （pH(i))、または細胞内 Na + アクティビティ (aNa(i))、調べたアフリカツメガエル卵母細胞に発現する zNBCe1 の機能.ゼブラフィッシュ NBCe1 共有トランスポート プロパティを持つ哺乳類 NBCe1s 無k Na + と HCO3 トランスポートと同様 4, 4'--ジイソプロプルフェノキシ thiocyano によって阻害を含む、類似の薬剤感受性を示す-2, 2'-ナフタレンジスルホン酸スチルベンと tenidap。これらのデータは、NBCe1 ゼブラフィッシュにおける組織分布、全身の水と電解質バランスと Na + と HCO3 - の起電力型マイクロ輸送における重要性を含む多くの特性と哺乳類の NBCe1 を共有することを示します。したがって NBCe1 生理研究有用なモデル システムでのゼブラフィッシュ約束。
人間 AQP1 のゼブラフィッシュ相同遺伝子のクローニングとキャラクタリゼーション： 2官水とガスのチャネル。
哺乳類のアクアポリン AQP1、AQP4、および AQP5 水チャンネルとしてだけでなく、ガスのチャネルとして機能するために示されています。ゼブラフィッシュ エンコーディングが AQP1 ホモログ、aqp1a と aqp1b 2 つの遺伝子があります。本研究では、ゼブラフィッシュ タンパク質 Aqp1a 72 h postfertilization (hpf） 胚のダニオ形態学からだけでなく、大人の浮袋エンコード cDNA のクローンを作成します。推定されるアミノ酸配列 aqp1a の 260 のアミノ酸で構成されています、59 ％ 人間 AQP1 に同一です。ゲノム DNA 配列の分析によって、4 つのエクソンの aqp1a の遺伝子を識別しました。In situ ハイブリダイゼーションによる aqp1a は一過性発展途上の血管と赤血球 16 から 48 h の開発に表現されます。後に 72 で hpf、aqp1a は、真皮 ionocytes と泳ぐ膀胱を表されます。成体組織の西部のしみの分析は、Aqp1a が最も高い目と泳ぐ膀胱で表現されることを明らかにします。アフリカツメガエル卵母細胞 aqp1a を表現するあるチャネルに依存する (※) の水透過性 (人間 AQP1 とは見分けがつかないです P(f)(*))。表面 pH の過渡変化の大きさに基づいて （卵母細胞が二酸化炭素または NH(3) のどちらかにさらされたことを記録した ΔpH(S)) 我々 は結論そのゼブラフィッシュ Aqp1a です二酸化炭素と NH(3) の両方に透水性。比率 (ΔpH(S)(*))((CO)2)/P(f)(*) は約半分人間 AQP1 及び比率は、（ΔpH(S)(*))(NH3)/P(f)(*) は四分の一について人間 AQP1 の。したがって、人間 AQP1、ゼブラフィッシュの Aqp1a 2 回選択性については二酸化炭素の上 NH(3) と比較してください。
ゼブラフィッシュFoxj1a転写因子は、損傷に応答し、上皮ストレッチで繊毛機能を調節する
繊毛は、通常の臓器機能と発達パターニングのために不可欠ですが、傷害と再生応答における役割は不明である。けがの繊毛の役割を調べるために、我々は組織の損傷と腎嚢胞形成への応答foxj1、繊毛遺伝子の転写調節因子の機能解析を行った。ゼブラフィッシュfoxj1aではなく、foxj1bは、急速に上皮伸展、ストレッチ、腎臓の嚢胞形成、ゲンタマイシンによる急性腎臓損傷、脊髄細胞の挫滅損傷に応答して誘導されました。 foxj1aの閉塞誘発アップレギュレーションは、上皮傷害に対する一次応答遺伝子としてfoxj1aを識別し、シクロヘキシミドにより阻害されていませんでした。同様に腎臓虚血再灌流障害への応答Foxj1はマウス嚢胞腎疾患の上皮[（ - / - ）JCK / JCK（nek8）とIft88Tg737Rpw]にも飛躍的にアップレギュレートされた。ゼブラフィッシュ前腎尿細管の閉塞は、拡張尿細管の直径および上皮ストレッチと緊密に相関している繊毛のビート速度の急速な増加を引き起こした。ゼブラフィッシュfoxj1aは、特に繊毛の運動性に必要であった。閉塞尿細管で強化されたfoxj1a式は、繊毛運動の標的遺伝子のefhc1、テクチン-1、dnahc9を誘発した。 foxj1a欠損胚はefhc1、テクチン-1、dnahc9をアップレギュレートし、損傷後の変調繊毛機能にfoxj1のために重要な役割を識別し、閉塞した後に強化された繊毛のビート率を維持することができませんでした。これらの研究は、そのciliogenic遺伝子のFoxj1転写ネットワークの活性化は、臓器の恒常性の以前に未同定成分として組織の損傷とハイライト強化された繊毛機能の複数のフォームに進化的に保存された応答で明らかにした。
ゼブラフィッシュ腎臓の開発
ゼブラフィッシュ前腎腎臓腎臓の発達と機能の有用な、関連するモデルを提供します。それは非常に哺乳類の腎臓の開発に関数を保存している転写因子によって調節されているすべての脊椎動物の腎臓と前腎器官形成に共通の細胞型から構成されています。前腎ネフロンは、上皮細胞型の尿細管のセグメンテーションと差別化の良いモデルです。前腎糸球体は、細胞の構造と血液のろ過装置を形成する細胞間相互作用を調節するアッセイ遺伝子機能への単純なモデルを提供しています。ゼブラフィッシュにおける遺伝子操作のしやすさを組み合わせた前腎、腎臓の相対的なシンプルさは、それがうまくFACSにより変異解析と遺伝子の発見、in vivoイメージング、他の種からの候補遺伝子の機能の画面、および細胞の分離に適しています。さらに、幼虫と成虫のゼブラフィッシュの腎臓は損傷後の腎臓の再生を研究するためのシステムとして浮上している。この章では、前腎の構造と開発の見直しと同様に前腎を研究するために、現在のメソッドを提供します。
流体の流れと集団的細胞遊走の指導。
集団細胞遊走後生動物の開発を含む多くの生物学的プロセスの重要なコンポーネントとして浮上している組織のメンテナンスと修理と腫瘍の進行。異なるコンテキストによっては、移行を誘導および維持は異なるメカニズムを指示します。大きなせん断応力を受ける血管内皮細胞の流体の流れを利用して細胞の移行グループを正しく方向づけるします。最近では、発展途上のゼブラフィッシュにおける上皮に向かって糸球体における上皮移行ガイド内腔の流体の流れは、同様の応答を受けるを発見しました。大町の移行は、腎臓の形態の大幅な変更に します。この新規プロセス強力な in vivo モデル メカノトランスダクションと集団移動機構の探査を提供します。
ADPKD 遺伝子 Pkd1a/b と Pkd2 は、細胞外マトリックス形成を調節します。
Polycystin1 の変異 (PKD1) アカウント常染色体優性多発嚢胞腎 (adpkd) の大半。PKD1 変異も血管動脈瘤と腹壁ヘルニア, polycystin1 の細胞外マトリックス (ECM) 整合性の役割を示唆に関連付けられています。ゼブラフィッシュでは、PKD1 パラログ pkd1a と pkd1b の複合ノックダウンの背側軸曲率, 水頭症、軟骨と顎顔面欠損における嚢胞の低周波数 （10-15 ％） で起因しました。曲率の背側軸は pkd2 ノックダウン胚で観測される軸欠陥と同じだった。複合 pkd1a/b、pkd2 のノックダウンはこれらの遺伝子の軸の形態形成を対話実証。背側軸曲率脊索コラーゲンの過剰発現をリンクされていたし、col2a1 mrna ノックダウンまたはコラーゲン架橋の化学阻害による逆できます。pkd1a/b の- と pkd2-欠損胚は異所性、永続的な発現するコラーゲン遺伝子の発現を通常制限負帰還信号の損失を示唆して、複数のコラーゲン Mrna を出展しました。Pkd1a/b のノックダウンはまた劇的に胚 implicating polycystins コラーゲン式またはアセンブリの変調に直接コラーゲン架橋阻害剤は、低線量増感。ワルトマニンと処理胚または LY 29400 もホスホイノシチド 3-キナーゼ （PI3K） の負のフィードバック経路制御マトリックス遺伝子発現のシグナルで implicating col2a1 式の dysregulation を展示します。Pkd1a/b と pkd2 ECM 分泌またはアセンブリ、規制する対話し、その変質行列整合性 ADPKD 組織病理学の基になる主な欠陥がありますが示唆されました。
チューブリン チロシン リガーゼのような遺伝子 Ttll3 と Ttll6 ゼブラフィッシュ繊毛構造と運動性を維持します。
チューブリン修飾微小管の不均質生成し微小管機能を調節してチューブリン チロシン リガーゼのような (TTLL) タンパク質によって触媒されます。Monoglycylated、polyglycylated、および glutamylated チューブリン全体のマウント immunostaining ゼブラフィッシュ胚の中に特定の抗体を使用して、個別の組織固有のパターン チューブリンの修正を観察しました。チューブリン修飾パターン繊毛における ttll3 および繊毛細胞における ttll6 の発現と相関した.すべてゼブラフィッシュ チューブリン チロシン リガーゼのような遺伝子の発現スクリーニング追加組織特異的発現 ttll1 脳のニューロン、筋、ttll4 および ttll7 耳プラコードに明らかにしました。Ttll3 のノックダウンは繊毛チューブリン glycylation を排除が、驚くほど穏やかな繊毛構造と運動性の影響を持っていた。同様に、ttll6 のノックダウンは繊毛チューブリン glutamylation がのみ部分的に影響を受ける繊毛構造と運動性強く減る。Ttll3 と ttll6 の機能の合計損失近く繊毛運動の完全な損失を生じるし、鞭毛微細構造欠陥と同様に以前チューブリン glutamylation を欠いていることが示されたゼブラフィッシュの逃亡者変異で観測される欠陥の様々 なを誘導しました。一貫して、逃亡者変異体はまたチューブリン glycylation を欠いていることを見つけます。チューブリン glycylation と glutamylation 繊毛構造と運動性を維持するため、重複する機能があることと逃亡者/dyf-1 の TPR タンパク質翻訳後修飾チューブリンの両方のタイプの必要であることが示唆されました。
Polycystins、焦点接着斑と細胞外マトリックスの相互作用。
多嚢胞性腎疾患は人間の最も一般的な遺伝性疾患です。腎臓、肝臓および膵臓における上皮嚢胞に加えては常染色体優性多発嚢胞腎 (adpkd) 患者もしばしば変えられた細胞外マトリックスの生産または整合性に関連付けられた腹部ヘルニア, 脳動脈瘤, 消化管嚢胞および心臓弁膜障害条件に苦しみます。プリンシパルの ADPKD 遺伝子の PKD1 と PKD2 の仕事の 10 年以上にもかかわらず、嚢胞性疾患の基礎と ADPKD 病理学における細胞外マトリックスの役割について質問は残る。このレビューのリンク polycystins、焦点接着斑と細胞外マトリックス遺伝子発現の間を探る。これらの関係をシグナリングその制御マトリックス セル マトリックス機械刺激受容における polycystins の役割提案生産と形態形成。この記事と題する特集の一部です: 多嚢胞性腎疾患。
館長 II における腎臓開発を促進し、繊毛を安定化 PKD2 のターゲットです。
細胞内の Ca²⁺ 信号原腸陥入、ニューロン新生、まだ定義されている経路を介しての器官形成に影響を与えます。1 つの潜在的な Ca²⁺ メディエータのこれらの形態形成プロセスの多くの保存されたカルモデュリン依存性プロテインキナーゼ館長 II です。長期 Ca²⁺ 刺激館長 II は、ゼブラフィッシュでは、前脳、耳、腎臓で検出されるアクティブの状態に変換します。多発性嚢胞腎疾患が抑制の脊椎動物のモデル生物で結果が腎嚢胞の変異 Ca²⁺ 実施 TRP の家族の一員 PKD2 にリンクされています。PKD2 欠損と館長 II 欠損ゼブラフィッシュ胚におけるダクトが正しく形成し、前方嚢胞と不安定クロアカ繊毛展示に失敗します。恒常活性館長 II におけるダクト形成 pkd2 morphants で復元に対し PKD2 抑制館長-II における細胞と繊毛、不活化されます。PKD2 と館長 II 欠陥同じ遺伝経路でその存在を支える相乗、です。館長 II 重要なエフェクター PKD2 Ca²⁺ 両方における腎臓の形態形成を促進し、プライマリ クロアカ繊毛を安定化させるのと考えられた.
開発における繊毛関数。
発生遺伝学とひと疾患遺伝子クローニングの最近の進歩による繊毛の発達の細胞運命決定、左右非対称性、人間の先天性疾患の病態の本質的な役割を強調しています。感覚の繊毛におけるヘッジホッグを示しています繊毛膜 (パッチ適用と滑らかにされた） に人身売買の受容体の重要性と繊毛 'エントリを制限するゲートキーパー' の概念と繊毛蛋白質の出口 (サプレッサーの融合: Gli 錯体)。繊毛駆動流動胚のノードで生成と開発における機械的信号検出における繊毛の役割を強調表示します。この短いレビューで私の最近の研究が明らかに、我々 の理解の役割開発における繊毛の連結の例を選択します。
