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Articles by Joanna B. Goldberg in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Purificazione e visualizzazione di lipopolisaccaride da batteri Gram-negativi da Hot acquosa-fenolo di estrazione
Department of Microbiology, Immunology, & Cancer Biology, University of Virginia Health System
Descriviamo una modificato caldo acquosa-fenolo metodo di estrazione per purificare lipopolisaccaride (LPS) da batteri Gram-negativi. Una volta estratto, le LPS può essere successivamente analizzati mediante SDS-PAGE e visualizzati tramite colorazione diretta o immunoblot occidentale.
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Costruzione E Caratterizzazione Di Un Mutante Di Delezione AroA Vivo, Attenuato Di Pseudomonas Aeruginosa Come Un Vaccino Intranasale Del Candidato
Anticorpi all'antigene di Pseudomonas aeruginosa lipopolisaccaride O mediano l'immunità ad alto livello, ma gli epitopi protettivi hanno dimostrato di essere scarsamente immunogenico, mentre gli epitopi dell'antigene O nonprotective o minimamente protettivi spesso suscitano le migliori risposte immunitarie. Con l'obiettivo di sviluppare un vaccino protettivo ampiamente p. aeruginosa, abbiamo utilizzato un sistema di sostituzione genica basato sulla ricombinasi Flp per costruire un mutante di delezione aroA contrassegno del sierogruppo di p. aeruginosa O2/O5 strain PAO1. Il mutante di delezione aroA risultante di PAO1 è designato PAO1 Delta aroA. L'eliminazione di aroA è stata confermata da PCR e fallimento del mutante di crescere su media minimi privo di amminoacidi aromatici. Quando viene valutata per la sicurezza e l'immunogenicità nei topi, Delta PAO1 aroA potrebbe essere applicato intranasale o intraperitoneale a dosi fino a 5 x arrecavano CFU per mouse senza effetti negativi. È stata rilevata alcuna diffusione di aroA PAO1 Delta a sangue, fegato o milza dopo applicazione intranasale, ed evidenza istologica di polmonite era minima. Immunizzazione intranasale di topi e conigli hanno suscitato alti titoli di immunoglobuline G di cellule batteriche intere e di antigeni batterici termostabili tutti i sette prototipiche p. aeruginosa sierogruppo O2/O5 ceppi. Gli antisieri mouse mediata potente fagocitaria uccisione della maggior parte dei ceppi di O2/O5 sierogruppo prototipiche, mentre gli antisieri di coniglio mediata fagocitaria uccisione di diversi ceppi sierogruppo-eterologa oltre uccidendo tutti i ceppi di O2/O5. Questo vivo, attenuato ceppo di p. aeruginosa PAO1 Delta aroA sembra essere sicuro per l'uso potenziale come un vaccino intranasale e suscita alti titoli di anticorpi opsonic più ceppi della p. aeruginosa O2/O5 sierogruppo.
Protezione Contro La Polmonite Fatale Di Pseudomonas Aeruginosa in Topi Dopo Immunizzazione Nasale Con Un Mutante Di Delezione AroA Vivo, Attenuato
Studi di immunità per Pseudomonas aeruginosa hanno indicato che una varietà di potenziali immunogeni può suscitare protezione in modelli animali, che utilizzano entrambi effettori immunitaria anticorpale e cellulo-mediata per la protezione. Per tentare di ottimizzare la consegna di più antigeni protettivi e suscitare una vasta gamma di effettori immuni, abbiamo prodotto un mutante di delezione aroA del sierogruppo di p. aeruginosa O2/O5 strain PAO1, designato PAO1deltaaroA. In precedenza, abbiamo segnalato che questo ceppo induce alti livelli di opsonic anticorpo diretto contro molti ceppi di O2/O5 sierogruppo dopo immunizzazione nasale di topi e conigli. Qui, abbiamo valutato l'efficacia protettiva di immunizzazione con PAO1deltaaroA contro la polmonite acuta fatale nei topi. Dopo immunizzazione attiva, sono stati raggiunti alti livelli di protezione contro una ExoU-esprimendo citotossica variante del ceppo parentale PAO1 a dosi fino a 1,000-fold maggiore della dose letale 50%. Significativa protezione contro PAO1 e due dei quattro altri ceppi di O2/O5 sierogruppo inoltre è stato trovato, ma non non c'era alcuna protezione contro ceppi sierogruppo-eterologa. I sierogruppo O2/O5 ceppi non protetti contro furono uccisi nel modo più efficiente i ceppi con cui è stato visto protezione, che indica una mancanza di correlazione della protezione e dell'uccisione di opsonic all'interno il sierogruppo in dosaggi opsonophagocytic. In esperimenti di immunizzazione passiva con sfida con selvaggio-tipo PAO1 o altri membri noncytotoxic del sierogruppo di O2/O5, non c'era alcuna protezione nonostante la presenza di elevati livelli di anticorpi opsonic la sera del mouse. Tuttavia, immunizzazione passiva ha impedito la mortalità da polmonite dovuto la variante PAO1 citotossica a dosi basse-sfida. Questi dati suggeriscono che una combinazione di immunità cellulare e umorale è necessaria per la protezione contro p. aeruginosa infezioni polmonari, che tale immunità può essere suscitato utilizzando mutanti di delezione di aroA, e che un vaccino polivalente p. aeruginosa composta da mutanti di delezione aroA dei sierogruppi più significativi promette.
Il GalU Gene Di Pseudomonas Aeruginosa è Necessaria Per L'infezione Corneale Ed Efficiente Diffusione Sistemica a Seguito Di Polmonite, Ma Non Per Infezione Confinata Al Polmone
Polmoniti acute infezioni corneale dovute a Pseudomonas aeruginosa sono in genere causate da lipopolisaccaride (LPS)-liscio ceppi. Nei pazienti di fibrosi cistica, tuttavia, LPS-rough ceppi di p. aeruginosa, quale antigene O mancanza, possono sopravvivere nel polmone e causare l'infezione cronica. Non è chiaro se un fenotipo LPS-rough colpisce citotossicità relative al tipo sistema di secrezione di III (SS3). Abbiamo precedentemente segnalato tale interruzione del gene galU in p. aeruginosa risultati nella produzione di un LPS ruvido e troncato core LPS. Qui abbiamo valutato il ruolo del gene galU nella patogenesi del polmone murino e infezioni agli occhi e di citotossicità a causa del effector SS3 ExoU. Abbiamo studiato galU mutanti di strain PAO1, della sua variante citotossici esprimendo ExoU da un plasmide e del ceppo citotossico intrinsecamente PA103. I mutanti galU erano siero più sensibile rispetto i ceppi parentali ma è rimasto citotossici in vitro. In un modello di infezione corneale, i mutanti galU erano notevolmente attenuati. In un modello di polmonite acuta, il 50% di dosi letali di mutanti galU erano superiori a quelli dei corrispondenti ceppi wild-type, eppure questi mutanti potrebbero causare mortalità e grave polmonite, giudicata da istologia, anche con minima diffusione sistemica. Questi risultati suggeriscono che il gene galU è necessario per l'infezione corneale e per l'efficiente diffusione sistemica dopo infezione polmonare ma non è richiesto per infezione confinata al polmone. Host difese polmonari sembrano essere insufficienti per controllare l'infezione da p. aeruginosa LPS-ruvido quando i livelli batterici locali sono alti.
Immunizzazione Intranasale Con Polisaccaride Heterologously Espresso Protegge Contro Molteplici Infezioni Di Pseudomonas Aeruginosa
Espressa in superficie Polisaccaridi batterici sono spesso immunodominanti, antigeni protettivi. Tuttavia, questi antigeni sono chimicamente e sierologicamente altamente eterogenei e coniugazione ai vettori della proteina è spesso necessario per migliorare la loro immunogenicità. Qui mostriamo l'efficacia dell'immunizzazione intranasale di topi con attenuato Salmonella enterica sierotipo Typhimurium esprimendo la porzione di antigene O di lipopolisaccaride di Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa è un sistema di modello ideale perché può causare una miriade di infezioni localizzate e sistemiche. In particolare, questo batterio è delle principali cause di polmonite acquisita in ospedale ed è responsabile di infezioni dopo ustioni e lesioni agli occhi. In aggiunta, ci sono modelli del mouse dell'infezione che imitano le manifestazioni cliniche delle infezioni da p. aeruginosa. Topi immunizzati erano altamente protetti contro l'infezione, con immunità duratura di polmonite acuta p. aeruginosa, mentre topi immunizzati con Salmonella contenente solo la clonazione vector o PBS non erano. Profilattici e terapeutici somministrazione di sieri di animali vaccinati protetto topi ingenui. La vaccinazione intranasale anche fornito una protezione completa da infezioni dopo ustioni e ridotto la patologia dopo abrasioni corneali. Questi risultati indicano che consegna intranasale di antigeni polisaccaride heterologously espresso fornisce protezione presso diversi siti di infezione. Questo approccio per l'espressione e la consegna degli antigeni polisaccaride come immunogeni ricombinante può essere facilmente adattato per sviluppare vaccini per molti agenti infettivi, senza la necessità di complicate purificazione e procedure di coniugazione.
Morte Di Pilus-mediata Delle Cellule Epiteliali in Risposta All'infezione Da Burkholderia Mallei
Burkholderia mallei sono un patogeno opportunistico che può causare gravi infezioni in fibrosi cistica pazienti (CF). Il lignaggio ET12 appare particolarmente virulento in CF; Tuttavia, la patogenesi sono poco compreso e possono essere associati con risposta ospite. Per aiutare a caratterizzare questa risposta, è stata esaminata la capacità di indurre citotossicità e l'apoptosi in un modello delle cellule epiteliali b. mallei. Dopo l'infezione con b. mallei strain K56-2, nelle cellule epiteliali del polmone umano A549 ha subito morte cellulare significativo; propidium iodio colorazione e dosaggi di frammentazione del DNA, ha suggerito il apoptosis. Iniziazione della morte delle cellule è stato indipendente del sistema di secrezione di tipo III, formazione di biofilm e secrete citotossine batteriche. Tuttavia, la frequenza di morte cellulare era inferiore nelle cellule infettate con un mutante non-piliated, cblA::Tp K56-2. Inoltre, sono stati trovati cbl purificato pili direttamente indurre citotossicità nelle cellule A549 e attivare il caspase-9, -8, -7 e -3, la cisteina principali proteinases coinvolti nell'apoptosi. Sembra che b. mallei cbl pili, che sono una caratteristica distintiva del lignaggio ET12, agiscono come un iniziatore di citotossicità e l'apoptosi. Comprensione del ruolo della cbl pili nella patogenesi delle infezioni da b. mallei offre il potenziale per ridurre la virulenza di questi organismi potenzialmente letali nei pazienti CF.
IL 17 è Un Componente Fondamentale Di Protezione Indotta Dal Vaccino Contro L'infezione Polmonare Da Lipopolisaccaride-eterologo Ceppi Di Pseudomonas Aeruginosa
In un modello murino di polmonite acuta fatale, abbiamo precedentemente dimostrato che l'immunizzazione nasale con un vivo attenuato aroA deletant del ceppo di Pseudomonas aeruginosa PAO1 ha suscitato la protezione specifica del sierogruppo LPS, indicante che Ab opsonic del LPS O AG era il più importante effector immuni. Perché p. aeruginosa strain PA14 possiede fattori di virulenza aggiuntivi, abbiamo ipotizzato che un vaccino vivo attenuato basato su PA14 potrebbe suscitare una gamma più ampia di effettori immuni. Così, un aroA deletant di PA14, indicato con PA14DeltaaroA, è stato costruito. Topi immunizzati PA14DeltaaroA sono state protette contro la polmonite letale causata non solo dal ceppo parentale ma anche da citotossici varianti dei ceppi di p. aeruginosa O Ag-eterologo PAO1 e PAO6a, m. notevolmente, siero da topi immunizzati PA14DeltaaroA aveva livelli molto bassi di attività opsonic contro strain PAO1 e non poteva trasferire passivamente protezione, suggerendo che un meccanismo indipendente dall'anticorpo era necessario per la protezione della Croce-sierogruppo osservati. Rispetto ai topi di controllo, topi immunizzati PA14DeltaaroA avevano più rapido reclutamento dei neutrofili alle vie aeree presto dopo la sfida. Cellule T isolate da P. aeruginosa topi immunizzati DeltaaroA proliferato e prodotto IL-17 in quantità elevata dopo coculture con gentamicina-ucciso p. aeruginosa. Sei ore dopo sfida, topi immunizzati PA14DeltaaroA erano significativamente più alti livelli di IL-17 nel fluido di lavaggio broncoalveolare confrontato con unimmunized, Escherichia coli-immunizzato, o topi immunizzati PAO1DeltaaroA. Anticorpo-mediata deplezione di IL-17 prima sfida o l'assenza del recettore IL-17 abrogato protezione PA14DeltaaroA del vaccino contro la polmonite letale. Questi dati mostrano che IL 17 gioca un ruolo critico nella Anticorpo-indipendente protezione indotta dal vaccino contro LPS-eterologo ceppi di p. aeruginosa nel polmone.
Mucosa Vaccinazione Con Un Vaccino Polivalente, Vivo Attenuato Induce Multifattoriale Immunità Contro L'infezione Da Pseudomonas Aeruginosa Polmonare Acuto
Molti studi su animali indagando effettori immuni adattivi importante per la protezione contro Pseudomonas aeruginosa sono implicati opsonic anticorpi agli antigeni antigenico variabile lipopolisaccaride (LPS) O come un effettore primario. Tuttavia, la vaccinazione attiva e passiva degli esseri umani contro questi antigeni non ha dimostrato efficacia clinica. Abbiamo ipotizzato che l'immunità ottima richiederebbe che inducono molteplici effettori immuni targeting più antigeni batterici. Quindi, abbiamo valutato una strategia polivalente vaccinazione mucosale vivo attenuato in un modello murino di polmonite acuta p. aeruginosa per valutare i contributi all'efficacia protettiva dei vari antigeni batterici e host effettori immuni. I vaccini che combina 3 o 4 ceppi attenuati avendo diversi sierogruppi di LPS sono stati associati con la massima efficacia protettiva rispetto ai vaccini con minor numero di componenti. Livelli di anticorpi opsonophagocytic, che erano diretti non solo agli antigeni O LPS, ma anche per la LPS core e proteine della superficie, correlata con l'immunità protettiva. I vaccini plurivalenti vivo attenuato superarono previo problemi che coinvolgono interferenza immunologica nello sviluppo di risposte dell'anticorpo O antigene-specifici quando gli antigeni O strettamente correlati sono stati combinati in vaccini plurivalenti. Anticorpi anti-nucleo LPS sono stati associati con l'uccisione in vitro e in vivo protezione contro ceppi con antigeni O non espressi dai ceppi del vaccino, considerando che gli anticorpi per la LPS core e le proteine di superficie aumentata il contributo degli anticorpi anti-antigene-specifici O provocata da ceppi di vaccino contenente un antigene omologo O. Cellule T CD4 locali nel polmone anche contribuirono alla protezione basata su vaccino quando opsonophagocytic anticorpi al ceppo sfida erano assenti. Così, vaccini plurivalenti vivo attenuato suscitano multifattoriale immunità protettiva per p. aeruginosa infezioni polmonari.
