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Articles by Luciana Madeira da Silva in JoVE
JoVE General
Mutagénesis y análisis de mutaciones genéticas en la secuencia del receptor GC-ricos KISS1 identificado en el hombre con Trastornos del aparato reproductor
1Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Molecular and Cellular Pharmacology, University of Miami Miller School of Medicine
Las mutaciones en el receptor kisspeptina (KISS1R) se asocian con trastornos de la reproducción en los pacientes. A continuación se describe la forma de introducir las mutaciones de interés en la secuencia rica en GC de KISS1R, así como el uso de construcciones KISS1R para caracterizar la vía de degradación del receptor por inmunoprecipitación y Western Blot
Other articles by Luciana Madeira da Silva on PubMed
La Expresión Regulada De La Leishmania Virulencia Superficial Importante Factor Lipophosphoglycan Uso Condicional Había Desestabilizado Proteínas De Fusión
Superficies glicoconjugados desempeñan papeles importantes en el ciclo infeccioso de Leishmania major, incluyendo la lipophosphoglycan abundante (LPG) implicado en la supervivencia del parásito en el vector de la mosca de la arena y las etapas iniciales del establecimiento en el macrófago huésped mamífero. Se describe un sistema de expresión inducible de LPG, aplicando un novedoso sistema de base proteica que permite la degradación controlada de una enzima biosintética clave LPG, UDP-galactopyranose mutase (UGM). Esta metodología se basa en una proteína mutada de FK506-binding (FKBP) desestabilizar el dominio (dd) fusionado a la proteína de interés; en ausencia de rapamicina análogos, tales como Shld1, el dominio de la dd es desestabilizado, conduciendo a la degradación proteasomal, Considerando que el tratamiento farmacológico confiere estabilización. Las pruebas en L. major con fusiones de dd a un panel de periodistas y proteínas celulares confirmaron su funcionalidad, con un alto grado de regulación y bajo fondo, y establecimos la cinética de activación de la proteína o pérdida. Dos barato y ampliamente disponibles ligandos, FK506 y rapamicina, funcionaban de manera similar a Shld1, sin efecto en el crecimiento de Leishmania o diferenciación. Generamos parásitos falta UGM a través de la eliminación del gen GLF y sustitución con una construcción de fusión ddGLF, pines cromosómicas o a través de la complementación episomal; Estos demostraron poca o ninguna expresión de LPG en ausencia del inductor, mientras que en su presencia, altos niveles de gas licuado se lograron rápidamente. Complemento lisis pruebas confirmaron la integridad correcta de la capa de LPG de Leishmania. Estos datos sugieren que el enfoque de dd tiene gran promesa en el estudio de LPG y otras vías pertinentes a la virulencia y la supervivencia del parásito.
Expansión Del Objetivo De La Familia De Quinasas De Rapamicina (TOR) Y Función En Leishmania Muestra Que TOR3 Es Necesario Para Acidocalcisome La Biogénesis Y Animal Infectividad
Objetivo de quinasas de la rapamicina (TOR) son reguladores claves del crecimiento celular, proliferación y estructura en eucariotas, procesos que están altamente coordinados durante el ciclo infeccioso de patógenos eucariotas. Minería de bases de datos reveló tres quinasas de TOR en el Trypanosomatida parásito Leishmania major, según lo definido por homología a la fosfatidilinositol 3-quinasa-related familia quinasa (PIKK) y una firma conservaron dominio FKBP12/rapamicina-obligatorio. En concordancia con los roles esenciales de complejos de TOR en otros organismos, fuimos incapaces de generar TOR1 nulo o cultivan de TOR2 mutantes en promastigotes principales L.. Por el contrario, fácilmente se obtuvieron mutantes nulos tor3(-); mientras que exhibe un crecimiento algo más lento, tor3(-) mantiene la morfología normal, la sensibilidad de la rapamicina y diferenciación en el animal-método infectiva. Significativamente, tor3(-) mutantes pudieron sobrevivir o replicar en macrófagos in vitro, o de inducir patología o establecer infecciones en ratones in vivo. La pérdida de virulencia se asoció con un defecto en la formación de acidocalcisome, como este organelo único grueso fue alterado en tor3-mutantes y polifosfatos no acumulada. En consecuencia, tor3-mutantes demostraron defectos en osmoregulación y fueron sensibles a la inanición de glucosa pero no los aminoácidos, glucosa, ser un nutriente limitante en la vacuola parasitófora. Así, en Leishmania, la familia de cinasa TOR se ha ampliado para abarcar un papel único en función de la CA y de la biología, que es esencial para la supervivencia del parásito en los mamífero infectiva. Dado su papel importante en la supervivencia celular y virulencia, inhibición de la función de cinasa TOR en trypanosomátidos ofrece un atractivo destino para la quimioterapia.
La Susceptibilidad De Los Patógenos Trypanosomatida a Inhibidores De La Cinasa PI3/mTOR Brinda Una Nueva Oportunidad Para La Reasignación De La Droga
Reasignación de destino utiliza el conocimiento de los objetivos "druggable" obtenidos en un organismo y aprovecha esta información para alcanzar nuevos objetivos de medicamentos potenciales en otros organismos. Aquí describimos tales estudios para evaluar si son prometedores inhibidores contra el dominio de la cinasa de fosfatidilinositol-3-quinasas humanas (PI3Ks) los mamíferos objetivo de rapamicina (mTOR) contra la HSP70 parásitos Trypanosoma brucei, T. cruzi, Leishmania major y L. donovani. Los genomas de trypanosomátidos codifican por lo menos 12 proteínas pertenecientes a la superfamilia de proteínas de PI3K, algunas de las cuales son únicas a los parásitos. Por otra parte, la PI3Ks compartido difieren mucho en la secuencia de los del anfitrión humano, proporcionando oportunidades para inhibición selectiva.
