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Articles by M. Jason V. de la Cruz in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Determinazione di strutture molecolari di glicoproteine dell'HIV Busta con Cryo-Electron Positron e automatizzato Sub-tomogramma Averaging
1Laboratory of Cell Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2The Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, 3National Library of Medicine, National Institutes of Health, 4Massachusetts Institute of Technology, 5William Fremd High School, 6University of Virginia, 7Duke University, 8Yale University, 9University of Notre Dame, 10Washington University in St. Louis, 11Bioinformatics and Computational Biosciences Branch, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 12Thomas Jefferson High School for Science and Technology
Il protocollo descrive un approccio high-throughput per determinare le strutture di proteine di membrana con crio-elettroni tomografia ed elaborazione delle immagini 3D. Esso copre i dettagli della preparazione dei campioni, raccolta, elaborazione e interpretazione dei dati, e si conclude con la produzione di un bersaglio rappresentante per l'approccio, l'HIV-1 glicoproteina Busta. Queste procedure di calcolo sono stati progettati in un modo che consente ai ricercatori e agli studenti di lavorare in remoto e contribuire alla elaborazione dei dati e l'analisi strutturale.
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Architetture Molecolari Di Glicoproteine Busta Trimeric SIV E HIV-1 Su Virus Intatto: Ceppo-dipendente Dalla Variazione Nella Struttura Quaternaria
Il passo iniziale per infezione delle cellule bersaglio da umani e il virus dell'immunodeficienza delle scimmie strettamente correlate (HIV e SIV, rispettivamente) si verifica con l'associazione di glicoproteine busta trimeric (Env), composto da eterodimeri della glicoproteina transmembrana virale (gp41) e superficie glicoproteina (gp120) a bersaglio le cellule T. Conoscenza della struttura molecolare di Env trimeric su virus intatto è importante per comprendere i meccanismi molecolari sottostanti le interazioni virus-cellula e per la progettazione di vaccini basati su immunogen efficaci combattere l'HIV/AIDS. Analisi precedenti di virioni di HIV-1 BaL intatte già hanno portato a strutture di Env trimeric in unliganded e CD4-liganded afferma a risoluzione Å ~ 20. Qui, ci mostra che le architetture molecolari di Env trimeric da SIVmneE11S, SIVmac239 e l'HIV-1 R3A ceppi sono strettamente paragonabili a quella determinata in precedenza per BaL di HIV-1, con la V1 e V2 cicli variabile si trovano all'apice del picco, vicino alla zona di contatto tra virus e cellula. La posizione delle anse V1/V2 in Env trimeric fu definitivamente confermata dall'analisi strutturale dei virioni di HIV-1 R3A ingegnerizzato di Env espressa con eliminazione di questi cicli. Sorprendentemente, in SIV CP-MAC, un ceppo di CD4-indipendente, Env trimeric è in una conformazione costitutivamente "aperta" con gp120 trimeri strombate in una conformazione simile a quello visto per Env di HIV-1 BaL quando è complessato con sCD4 e il CD4i anticorpo 17b. I nostri risultati suggeriscono una spiegazione strutturale per il meccanismo molecolare di entrata virale CD4-indipendente e ulteriormente stabilire che tomografia del cryo-elettrone può essere utilizzata per scoprire distinte, funzionalmente rilevanti strutture quaternarie di Env visualizzati su virus intatto.
Strutture Tridimensionali Degli Stati Associati a CD4 Solubili Di Glicoproteine Di Busta Del Virus Dell'immunodeficienza Delle Scimmie Trimeric Determinate Mediante Tomografia Computerizzata Cryo-elettrone
Le punte di glicoproteina (Env) trimeric busta visualizzate sulla superficie del virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV) e virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) virioni sono composte da tre eterodimeri di glicoproteine virali gp120 e gp41. Anche se il legame di gp120 di cellule CD4 superficiale e un recettore delle chemochine è noto per provocare alterazioni conformazionali gp120 e gp41, cambiamenti nella struttura quaternaria di trimero solo di recente sono state chiarite. Per isolare il BaL di HIV-1, CD4 attaccamento provoca un riarrangiamento colpisce il trimero da un "chiuso" ad una conformazione "aperta". L'effetto di CD4 su trimeri SIV, tuttavia, non è stata descritta. Utilizzando la tomografia cryo-elettrone, ora abbiamo determinato architetture molecolari del CD4 solubile (sCD4)-Stati di SIV Env trimeri per tre diversi ceppi (SIVmneE11S, SIVmac239 e SIV CP-MAC) legati. In netto contrasto con l'HIV-1 BaL, SIVmneE11S e SIVmac239 Env ha mostrato solo lievi cambiamenti conformazionali seguendo sCD4 associazione. In SIV CP-MAC, dove Env trimeric Visualizza una conformazione costitutivamente "aperta" simile a quello visto per Env di HIV-1 BaL nello stato sCD4-complessato, ci mostra che non ci sono cambiamenti significativi ulteriori nella conformazione dell'associazione del sCD4 o 7 3 anticorpo. Le mappe di densità mostrano anche che gli anticorpi 3 7 e 17b target epitopi su gp120 che sono su lati opposti del sito Associazione coreceptor. Questi risultati forniscono nuove intuizioni della diversità strutturale di SIV Env e mostrano che ci sono dipendenti dal ceppo variazioni nell'orientamento di sCD4 associato a trimeric SIV Env.
