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Analyse de l'interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement
1Genome Institute of Singapore, Agency for Science, Technology and Research, Singapore, 2A*STAR-Duke-NUS Neuroscience Research Partnership, Singapore, 3Department of Biochemistry, National University of Singapore, Singapore
Analyse de l'interaction de la chromatine par Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) est une méthode pour
Other articles by Melissa J. Fullwood on PubMed
Séquençage Multiplex De Paires De Gamme Bimarqueurs (MS-PET): Une Stratégie Pour L'analyse Ultra-haut Débit De Transcriptomes Et Des Génomes
Le appariées fin ditagging (PET) technique a été montré pour être efficace et précis à grande échelle du transcriptome et l'analyse du génome. Cependant, comme avec d'autres stratégies de balises basées sur le séquençage d'ADN, il est contraint par l'efficacité actuelle de la technologie Sanger. Un procédé de multiplexage récemment mis au point séquençage (454-séquençage) en utilisant picolitres échelle réactions a réalisé une avancée remarquable en matière d'efficacité, mais souffre de court lecture longueurs, et un manque de paires de fin d'information. Pour améliorer encore l'efficacité de l'analyse PET et en même temps remédier aux inconvénients de la méthode de séquençage nouvelle, nous avons couplé multiplex séquençage avec appariées fin ditagging (MS-PET) en utilisant des procédures PET modifiés à la fois la séquence 200.000 à 300.000 dimérisé PET (diPET modèles), avec une sortie de près d'un demi-million de séquences PET dans une seule marche de la machine 4 h. Nous démontrons l'utilité et la robustesse de MS-PET par analyse du transcriptome des cellules humaines de cancer du sein, et par des sites de cartographie de liaison de p53 dans le génome de cellules humaines de cancer colorectal. Cette stratégie de séquençage combiné obtenu une augmentation de l'efficacité approximative de 100 fois au cours de la norme actuelle pour l'analyse PET, et permet en outre le multiplex à court de lecture de longueur séquençage procédure d'acquisition associé-end à partir des informations grands fragments d'ADN.
L'utilisation De Amplification Par Déplacement De Multiples Bibliothèques Pour Amplifier L'ADN Complexes
Bibliothèques complexes pour l'ADN génomique et des analyses de séquençage d'ADNc sont généralement amplifiés en utilisant la propagation de bactéries. Pour réduire les biais, un grand nombre de colonies sont étalées et gratté de l'état solide-surface de la gélose. Ce processus prend du temps, fastidieux et limites d'échelle vers le haut. Dans le même temps, l'amplification par déplacement multiple (MDA) a été récemment mis au point une méthode pour l'amplification in vitro de l'ADN. Cependant, MDA n'a pas de fonction de sélection pour l'enlèvement de multimères de ligature. Nous avons développé une nouvelle méthode de présenter brièvement réactions de ligature dans des bactéries pour sélectionner simples clones d'ADN d'insertion suivies par MDA pour amplifier. Nous avons appliqué ces méthodes à un Signatures identification des gènes des paires de fin d'bimarqueurs (SIG-PET) de la bibliothèque, ce qui est une bibliothèque transcriptome complexe créé par appariement des balises courtes à partir de l'extrémité 5 'et 3' extrémités de fragments d'ADNc ensemble, et ont démontré que cette sélection et la stratégie d'amplification est impartiale et efficace.
ChIP-base Méthodes Pour L'identification Des Interactions à Longue Portée Chromatine
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une technique importante pour l'étude des interactions protéine-ADN. Whole méthodes ChIP du génome ont connu beaucoup de succès, mais ils sont limités en ce sens qu'ils ne peuvent pas découvrir d'importantes interactions à longue portée chromatine. Capture conformation chromosomique (3C) et les méthodes apparentées sont capables de détecter les interactions à distance chromatine, mais sont fastidieuses, ont de faibles signal sur bruit, et ne sont pas l'ensemble du génome. Bien que l'ajout de ChIP à 3C (ChIP-3C) serait concevable de réduire le bruit et la spécificité pour la détection d'interaction augmentation de la chromatine, il est à craindre que de simples protocoles de mélange de la puce et 3C conduiraient à des niveaux élevés de faux positifs. Dans cet essai, nous disséquons les méthodes actuelles puce et 3C-base, de discuter des modèles de spécifique, par opposition aux interactions chromatine non-spécifiques, et de suggérer des approches pour séparer complexes chromatiniens spécifiques à partir de fragments de chromatine non-spécifiques. Nous concluons que la combinaison de fragmentation de la chromatine sonication basée, sur puce d'enrichissement, la ligature de proximité de la chromatine et appariés Fin Tag ultra-séquençage à haut débit sera une mise en œuvre gagnante pour la découverte de l'échelle du génome, impartiale et de novo de longue portée interactions chromatine, qui aideront à établir un nouveau domaine pour l'étude de la chromatine interactomes de l'homme et des réseaux de régulation du génome dans des espaces tridimensionnels.
La Nouvelle Génération De Séquençage De L'ADN De Paires De Gamme Tags (PET) Pour Les Analyses Du Transcriptome Et Du Génome
Une compréhension approfondie des éléments fonctionnels dans le génome humain, il faudra d'interrogation approfondie et la comparaison des génomes individuels de l'homme et les structures génomiques. Une telle entreprise nécessitera des améliorations dans les débits et les coûts de séquençage de l'ADN. Plates-formes de séquençage de nouvelle génération ont des coûts remarquablement faible et des débits élevés, mais sont limités par des longueurs de lecture courtes. Une solution immédiate et largement reconnue à cette limitation critique est la balise de fin appariées (PET) de séquençage pour diverses applications, appelées collectivement la stratégie de séquençage PET, dans lequel les balises courtes et appariés sont extraites à partir des extrémités de longs fragments d'ADN pour les ultra-haute séquençage à-. Les séquences PET peut être mis en correspondance avec précision le génome de référence, ainsi délimiter les frontières de fragments d'ADN génomique PET-représentés et révélant des identités des éléments d'ADN cibles. Protocoles PET ont été développés pour les analyses de transcriptomes, les sites de liaison de facteurs de transcription, des sites épigénétiques telles que les sites de modification des histones, et les structures génomiques. L'avantage exclusif du PET est la technologie de sa capacité à découvrir des liens entre les deux extrémités des fragments d'ADN. Grâce à cette fonction unique, transcrits de fusion non conventionnelles, les variations du génome structurelles, et même des interactions moléculaires entre éloignés des éléments génomiques peuvent être anéantis par l'analyse PET. L'utilisation intensive des données TEP pourrait conduire à un montage efficace des génomes individuels de l'homme, transcriptomes et interactomes, permettant de nouvelles découvertes biologiques et cliniques. Avec sa nature souple et puissante pour l'analyse d'ADN, la stratégie de séquençage PET a un bel avenir.
Une Oestrogène-récepteur Alpha-humaine Liée Chromatine Interactome
Génomes sont organisés en haut niveau des structures tridimensionnelles, et des éléments d'ADN séparées par de longues distances génomiques peut interagir fonctionnellement en principe. De nombreux facteurs de transcription se lient à des éléments d'ADN régulatrices éloignées de promoteurs de gènes. Bien que distales des sites de liaison ont été montré pour réguler la transcription par la chromatine interactions à longue portée à quelques loci, les interactions de la chromatine et leur impact sur régulation de la transcription n'ont pas été étudiés d'une manière échelle du génome. Nous décrivons ici le développement d'une nouvelle stratégie, analyse de l'interaction de la chromatine par tag appariées fin séquençage (Chia-PET) pour la détection de novo des interactions chromatine mondiaux, avec lesquels nous avons complètement cartographié le réseau d'interaction chromatine lié par des récepteurs des oestrogènes alpha ( ER-alpha) dans le génome humain. Nous avons constaté que la plupart des sites de haute confiance distance ER-alpha-contraignant sont ancrés à des promoteurs de gènes grâce à des interactions à longue portée chromatine, ce qui suggère que ER-alpha fonctions par la chromatine vaste boucle pour mettre les gènes ensemble pour la régulation transcriptionnelle coordonnée. Nous proposons que les interactions chromatine constituent un mécanisme essentiel pour la régulation de la transcription dans les génomes de mammifères.
Analyse De L'interaction Chromatine Utilisant Le Séquençage De Tag Paired-end
Analyse de l'interaction en utilisant la chromatine Tag Paired-End séquençage (Chia-PET) est une technique développée à grande échelle, l'analyse de novo des structures chromatiniennes d'ordre supérieur. Les cellules sont traitées avec du formaldéhyde à des interactions chromatine réticuler, des segments d'ADN liés par des facteurs protéiques sont enrichies par immunoprécipitation de la chromatine, et l'interaction des fragments d'ADN sont alors capturés par ligature de proximité. Le appariés balise de fin (PET) stratégie est appliquée à la construction de Chia-PET bibliothèques, qui sont séquencés par technologies à haut débit de séquençage de prochaine génération. Enfin, PET séquences premières sont soumises à une analyse bioinformatique, résultant en une carte du génome entier de sites de liaison et les interactions de chromatine médiées par le facteur protéique à l'étude. Cette unité décrit Chia-PET pour l'ensemble du génome d'analyse des interactions dans la chromatine des cellules de mammifères, avec l'application de Roche/454 et technologies de séquençage Illumina.
Chia-PET Outil D'analyse De La Chromatine Interaction Complète Avec Séquençage Tag Appariés Fin
Analyse de l'interaction avec le tag chromatine appariées fin séquençage (Chia-PET) est une nouvelle technologie pour étudier l'ensemble du génome des interactions à longue portée chromatine liés par des facteurs protéiques. Ici, nous présentons Chia-PET Tool, un logiciel de traitement automatique des données de séquence Chia-PET, y compris le filtrage de liaison, la cartographie des balises à génomes de référence, les sites de liaison de protéines d'identification et les interactions chromatine, et afficher les résultats sur un navigateur graphique génome. Chia-PET outil est rapide, précis, complet, convivial, et l'open source (disponible à l'adresse http://chiapet.gis.a-star.edu.sg).
Séquençage De La Génération Des Points De Cassure D'ADN Apoptotique Révèle Associant Activement De Transcrits Des Gènes Et Des Translocations De Gène
Fragmentation de l'ADN est une caractéristique bien connue de l'apoptose. Cependant, les séquences d'ADN précis s'est fendues pendant l'apoptosis déclenchés par des mécanismes distincts restent floues. Nous avons utilisé la nouvelle génération de séquençage de fragments d'ADN générés dans les traités à l'actinomycine D humaines HL-60 cellules leucémiques pour générer un haut débit, la carte mondiale des points de cassure d'ADN apoptotique. Ces données mis en évidence que les cassures de l'ADN sont non aléatoires et montrent une association significative avec les gènes actifs et ouvrir les régions de chromatine. Nous avons constaté que les sites de liaison de facteurs de transcription ont été également enrichis dans une fraction des bornes de l'apoptose. Fait intéressant, apoptotic vaste clivage a été noté dans les gènes qui sont souvent transportés dans les cancers humains. Nous croyons que la fragmentation non aléatoire de l'ADN au cours de l'apoptose peut contribuer à des translocations de gène et le développement de cancers humains.
De Vastes Interactions Chromatine Promoteur Centrées Fournir Une Base Topologique Pour Le Règlement De Transcription
D'ordre supérieur pour l'organisation chromosomique régulation de la transcription est mal comprise chez les eucaryotes. En utilisant l'échelle du génome analyse de l'interaction avec la chromatine appariés balise de fin de séquençage (Chia-PET), nous avons cartographié les interactions à longue portée chromatine associés à l'ARN polymérase II dans les cellules humaines et découvert répandues interactions promoteur-centrée intragéniques, extragénique, et intergénique. Ces interactions en outre agrégés en un ordre supérieur grappes, dans lequel les gènes proximale et distale ont été engagés à travers promoteur-promoteur interactions. La plupart des gènes avec le promoteur-promoteur interactions ont été actifs et transcrite en collaboration, et certains promoteurs qui interagissent les uns des autres pourrait influer sur ce qui implique la complexité combinatoire des contrôles transcriptionnels. Des analyses comparatives des différentes lignées cellulaires ont montré que les interactions chromatine cellulaire spécifiques pourraient fournir des cadres structurels pour la cellule transcription spécifique, et a suggéré l'enrichissement significatif de enhancer-promoteur interactions cellule pour des fonctions spécifiques. En outre, génétiquement identifié les éléments non codants associés à la maladie ont été trouvés à être spatialement engagé avec les gènes correspondants par le biais interactions à longue portée. Dans l'ensemble, notre étude fournit un aperçu de régulation de la transcription par la chromatine interactions en trois dimensions à la fois pour l'entretien ménager et la cellule des gènes spécifiques dans les cellules humaines.
Le Ciblage De La Phosphorylation Du Facteur D'initiation Eucaryote-2α Pour Traiter Des Maladies Humaines
La réponse de la protéine dépliée, également connu sous le nom le stress du réticulum endoplasmique (ER), a été impliquée dans nombreuses maladies humaines, y compris les troubles de l'athérosclérose, le cancer, le diabète et neurodégénératives. Repliement active un ou plusieurs des trois capteurs transmembranaires ER pour initier un réseau complexe de signalisation qui supprime transitoirement la traduction des protéines tout en améliorant la dégradation des protéines protéasome et de pliage des protéines mal repliées pour assurer le recouvrement intégral de stress du re. Études de perturbation génique chez la souris ont fourni un aperçu critique le rôle des composants spécifiques de signalisation et les voies dans les différentes réponses de tissus animaux au stress du re. Ces études ont fait ressortir une importante contribution de répression traductionnelle de viabilité de synthèse et des cellules β insuline soutenue dans des modèles expérimentaux de diabète de type 2. Cela a attiré l'attention sur les inhibiteurs de petites molécules récemment découverts des phosphatases eIF2α qui prolongent la phosphorylation d'eIF2α afin de réduire la mort cellulaire dans plusieurs modèles animaux de maladies humaines. Ces composés présentent cytoprotection significative dans des modèles cellulaires et animaux de maladies neurodégénératives, mettant en évidence une stratégie potentielle pour le développement futur des médicaments pour traiter des protéines humaines mauvais repliement des troubles.
