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Articles by Neela Zareen in JoVE
JoVE General
Protocollo per la coltura neuroni simpatico da Rat gangli cervicale superiore (SCG)
1Department of Biology, Columbia University, 2Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University
Questo รจ un protocollo che descrive come isolare e colture primarie di neuroni simpatici gangli cervicale superiore (SCG) di cuccioli di ratto appena nati.
Other articles by Neela Zareen on PubMed
Residui Nel Suo Dominio Di Mosca Della Frutta TRNase Z Che Funzionano in Catalisi Non Sono Coinvolti Nel Riconoscimento Del Substrato O Associazione Conservata
Trasferimento RNAs sono trascritti come precursori con estensioni sia il 5' e 3' estremità. RNasi P rimuove endonucleolytically il leader di estremità 5'. tRNase Z può rimuovere endonucleolytically il 3' estremità trailer come un passo necessario nella maturazione del tRNA. CCA non è transcriptionally codificato nel tRNA di eucarioti, archaebacteria e alcuni batteri e dovrà essere aggiunti da un enzima CCA-aggiunta dopo la rimozione del trailer 3' estremità. tRNase Z è un membro della famiglia di idrolasi metallo-dipendente, la sequenza di firma di cui il cluster conservate istidina (HxHxDH), è essenziale per l'attività beta-lattamasi. A partire da Mosca della frutta espresse baculovirus tRNase Z, abbiamo completato una scansione di Ala 18 residui della sua cluster per analizzare il paesaggio funzionale di questa regione critica. Residui nel e intorno al suo cluster rientrano in tre categorie basate sugli effetti delle sostituzioni sull'efficienza di elaborazione: sostituzioni in otto residui hanno poco effetto, cinque sostituzioni riducono moderatamente l'efficienza (circa 5-50 volte), mentre le sostituzioni in cinque residui conservati, una serina, istidina tre e uno aspartato, gravemente ridurre efficienza (circa 500-5000-fold). Costanti di dissociazione wild-type e mutanti (valori di Kd), determinati utilizzando gel di turni, visualizzato sostanziali differenze e sono stati dello stesso ordine come kM (2-20 nM). Elaborazione inferiore efficienze derivanti da sostituzioni nel suo dominio sono quasi interamente dovuti a valori ridotti kcat; residui funzionalmente importanti, conservate all'interno del suo cluster di tRNase Z sono così coinvolti nella catalisi, e le funzioni di riconoscimento e legame del substrato devono risiedere altrove nella proteina.
Naturalmente Le Mutazioni Che Si Verificano Pre-tRNASer(UCN) Mitocondriale Umana Possono Influenzare Il Sito Di Clivaggio Ribonucleasi Z Trasferimento, Elaborazione Cinetica E Struttura Secondaria Del Substrato
tRNA è trascritti come precursori con un leader di estremità 5' e 3' estremità rimorchio. Il leader di estremità 5' è elaborato da RNasi P, e nella maggior parte degli organismi in tutti e tre i regni, trasferimento ribonucleasi (tRNase) Z può rimuovere endonucleolytically il trailer di estremità 3'. Long ((L)) e forme brevi ((S)) del gene della tRNase Z sono presenti nel genoma umano. tRNase Z(L) elabora una pre-tRNA nucleare codificato circa 1600-fold in modo più efficiente rispetto a tRNase Z (S) e si prevede di avere un segnale forte trasporto mitocondriale. tRNase Z(L) potrebbe, così, processo sia nucleare- ed mitochondrially con codifica pre-tRNAs. Più di 150 mutazioni associate a patogenesi sono state trovate nel genoma mitocondriale, la maggior parte di loro nel 22 tRNA mitochondrially codificato. Tutte le mutazioni indagate in tRNA(Ser(UCN)) mitocondriale umana possono influenzare l'efficienza di elaborazione, e alcuni possono influenzare il sito di clivaggio e struttura secondaria. Questi cambiamenti potrebbero influenzare il trattamento tRNase Z dei mutanti pre-tRNAs, forse contribuire alla malattia mitocondriale.
Residui in Due Blocchi Di Omologia Sul Lato Amminico Di TRNase Z Suo Dominio Inaspettatamente Contribuiscono a Pre-tRNA 3' Fine Lavorazione
tRNase Z, endonucleolytically che può rimuovere pre-tRNA 3'-fine rimorchi, possiede la firma del suo dominio (HxHxDH; Motif II) della famiglia delle idrolasi metallo-dipendente beta-lattamasi. Motivo II combina con motivi III-V su un lato carbossilico per coordinare due ioni metallici bivalenti, che costituiscono il nucleo catalitico. Il ciclo PxKxRN e Motif sul lato amminico del II motivo ho stato suggerito a modulare l'attività tRNase Z, compreso l'effetto anti-determinant di CCA in tRNA maturo. Ala passeggiate attraverso questi due blocchi di omologia rivelano residui in cui le sostituzioni inaspettatamente riducono l'efficienza catalitica. Mentre le sostituzioni in Motif II possono influenzare drasticamente k(cat) senza influire sulle k(M), aumenti di cinque - a 15 volte in k(M) sono osservati con le sostituzioni in diversi residui conservati nel ciclo PxKxRN e Motif I. Questi aumenti in k(M) suggeriscono un modello per l'associazione di substrato. Espresso tRNase Z i processi tRNA maturo con CCA all'estremità 3' circa 80 volte meno efficiente rispetto a un pre-tRNA che possiedono naturale sequenza di 3'-trailer finale, a causa della ridotta k(cat) senza alcun effetto sul k(M), mostrando il CCA anti-determinant essere una caratteristica di questo enzima.
