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Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

We report here the first three-dimensional structure of the type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP(3)R). From cryo-electron microscopic images of purified receptors embedded in vitreous ice, a three-dimensional structure was determined by use of standard single particle reconstruction techniques. The structure is strikingly different from that of the ryanodine receptor at similar resolution despite molecular similarities between these two calcium release channels. The 24 A resolution structure of the IP(3)R takes the shape of an uneven dumbbell, and is approximately 170 A tall. Its larger end is bulky, with four arms protruding laterally by approximately 50 A and, in comparison with the receptor topology, probably corresponds to the cytoplasmic domain of the receptor. The lateral dimension at the height of the protruding arms is approximately 155 A. The smaller end, whose lateral dimension is approximately 100 A, has structural features indicative of the membrane-spanning domain. A central opening in this domain, which is occluded on the cytoplasmic half, outlines a pathway for calcium flow in the open state of the channel.

Three-dimensional structure of the type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor at 24 A resolution.

Nous rapportons ici la premi&egrave;re structure tridimensionnelle du r&eacute;cepteur de type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate (IP(3)R). Des images microscopiques de cryo-&eacute;lectron de purifi&eacute;e r&eacute;cepteurs embarqu&eacute;s dans la glace vitrifi&eacute;e, une structure tridimensionnelle a &eacute;t&eacute; d&eacute;termin&eacute;e par l&#39;utilisation de techniques de reconstruction d&#39;une seule particule standard. La structure est remarquablement diff&eacute;rente de celle du r&eacute;cepteur de la ryanodine &agrave; r&eacute;solution similaire malgr&eacute; les similitudes mol&eacute;culaires entre ces deux canaux de lib&eacute;ration de calcium. Le 24 une structure de r&eacute;solution de l&#39;adresse IP (3) R prend la forme d&#39;une halt&egrave;re in&eacute;gale et est environ 170 A grand. Son extr&eacute;mit&eacute; la plus grande est volumineuse, avec quatre bras qui d&eacute;passent lat&eacute;ralement par environ 50 A et, par rapport &agrave; la topologie du r&eacute;cepteur, probablement correspond au domaine cytoplasmique du r&eacute;cepteur. La dimension lat&eacute;rale &agrave; la hauteur des bras saillants est environ 155 A. La plus petite extr&eacute;mit&eacute;, dont la dimension lat&eacute;rale est environ 100 A, a des caract&eacute;ristiques structurales indicatives du domaine transmembranaire. Une ouverture centrale dans ce domaine, qui est obtur&eacute; sur la moiti&eacute; cytoplasmique, d&eacute;crit une voie pour flux de calcium dans l&#39;&eacute;tat ouvert de la manche.

Structure tridimensionnelle du r&eacute;cepteur de type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate &agrave; une r&eacute;solution de 24.

Riportiamo qui la prima struttura tridimensionale del recettore del tipo 1 inositolo 1.4.5-trifosfato del (IP(3)R). Da immagini microscopiche di cryo-elettrone di recettori purificati incorporati nel ghiaccio vitreo, una struttura tridimensionale &egrave; stata determinata dall&#39;utilizzo di tecniche di ricostruzione standard della singola particella. La struttura &egrave; sorprendentemente diversa da quello del recettore rianodinico a simile risoluzione nonostante molecolare similitudini tra questi due canali di rilascio di calcio. Il 24 una struttura di risoluzione dell&#39;IP (3) R prende la forma di un manubrio irregolare ed &egrave; alto circa 170 A. L&#39;estremit&agrave; pi&ugrave; grande &egrave; ingombrante, con quattro braccia sporgenti lateralmente da circa 50 A e, nel confronto con la topologia del recettore, probabilmente corrisponde al dominio citoplasmatico del recettore. La dimensione laterale all&#39;altezza delle braccia sporgenti &egrave; circa 155 A. L&#39;estremit&agrave; pi&ugrave; piccola, la cui dimensione laterale &egrave; di circa 100 A, ha caratteristiche strutturali indicativi della membrana-spanning dominio. Un&#39;apertura centrale in questo dominio, che &egrave; nascosto sulla parte citoplasmatica, delinea un percorso per il flusso di calcio nello stato aperto del canale.

Struttura tridimensionale del recettore tipo 1 inositolo 1.4.5-trifosfato a 24 una risoluzione.

Voltage-dependent ion channels serve as field-effect transistors by opening a gate in response to membrane voltage changes. The gate's response to voltage is mediated by voltage sensors, which are arginine-containing structures that must move with respect to the membrane electric field. We have analysed by electron microscopy a voltage-dependent K(+) channel from Aeropyrum pernix (KvAP). Fab fragments were attached to 'voltage sensor paddles' and identified in the electron microscopy map at 10.5 A resolution. The extracellular surface location of the Fab fragments in the map is consistent with the membrane-depolarized, open conformation of the channel in electrophysiological experiments. Comparison of the map with a crystal structure demonstrates that the voltage sensor paddles are 'up' (that is, near the channel's extracellular surface) and situated at the protein-lipid interface. This finding supports the hypothesis that in response to changes in voltage the sensors move at the protein-lipid interface rather than in a gating pore surrounded by protein.

Electron microscopic analysis of KvAP voltage-dependent K+ channels in an open conformation.

Canaux ioniques voltage-d&eacute;pendants serve de transistors &agrave; effet de champ en ouvrant une porte en r&eacute;ponse aux variations de tension de membrane. R&eacute;ponse de la porte de tension est m&eacute;di&eacute;e par des capteurs de tension, qui sont contenant de l&#39;arginine structures qui doivent se d&eacute;placer en ce qui concerne le champ &eacute;lectrique de membrane. Nous avons analys&eacute; par microscopie &eacute;lectronique &agrave; un canal de k voltage-d&eacute;pendants de Aeropyrum pernix (KvAP). Fragments Fab &eacute;taient attach&eacute;s &agrave; la &#39;tension capteur pagaies&#39; et identifi&eacute;s dans le plan de la microscopie &eacute;lectronique &agrave; r&eacute;solution 10,5. L&#39;emplacement de surface extracellulaire de la Fab fragments dans le plan est conforme &agrave; la conformation-membrane d&eacute;polaris&eacute;e, ouverte du canal en exp&eacute;riences &eacute;lectrophysiologiques. Comparaison de la carte avec une structure cristalline d&eacute;montre que les palettes de capteur de tension sont &laquo; en haut &raquo; (c&#39;est-&agrave;-dire pr&egrave;s de surface extracellulaire de la cha&icirc;ne) et situ&eacute; &agrave; l&#39;interface de prot&eacute;ines-lipides. Ces r&eacute;sultats appuient l&#39;hypoth&egrave;se que, en r&eacute;ponse aux changements de tension les capteurs se d&eacute;placent &agrave; l&#39;interface de prot&eacute;ines-lipides plut&ocirc;t que dans un m&eacute;canisme de s&eacute;lection pore entour&eacute; de prot&eacute;ines.

Analyse au microscope &eacute;lectronique des canaux K + voltage-d&eacute;pendants de la KvAP dans une conformation ouverte.

Canali ionici voltaggio-dipendenti servono come transistor ad effetto di campo con l&#39;apertura di un cancello in risposta alle variazioni di tensione di membrana. Risposta del cancello a tensione &egrave; mediata dai sensori di tensione, che sono arginina-contenente strutture che devono muoversi per quanto riguarda il campo elettrico di membrana. Abbiamo analizzato da microscopia elettronica canale voltaggio-dipendente K(+) da Sulfolobus pernix (KvAP). Frammenti Fab sono stati associati al &#39;tensione sensore pale&#39; e identificati nella mappa di microscopia elettronica a 10,5 una risoluzione. La posizione di superficie extracellulare della Fab &egrave; coerente con la conformazione aperta, membrana-depolarized del canale in esperimenti elettrofisiologici frammenti della mappa. Confronto tra la mappa con una struttura di cristallo dimostra che le pale del sensore di tensione sono &#39;up&#39; (cio&egrave;, vicino a superficie extracellulare del canale) e situato all&#39;interfaccia proteina-lipidi. Questa scoperta supporta l&#39;ipotesi che i sensori spostare in risposta alle variazioni di tensione all&#39;interfaccia proteina-lipidi, piuttosto che in un controllo dei pori circondati da proteine.

Analisi microscopica di elettroni dei canali K + voltaggio-dipendenti KvAP in una conformazione aperta.

Cells communicate with their external environment through physical and chemical processes that take place in the cell-surrounding membrane. The membrane serves as a barrier as well as a special environment in which membrane proteins are able to carry out important processes. Certain membrane proteins have the ability to detect the membrane voltage and regulate ion conduction or enzyme activity. Such voltage-dependent processes rely on the action of protein domains known as voltage sensors, which are embedded inside the cell membrane and contain an excess of positively charged amino acids, which react to an electric field. How does the membrane create an environment suitable for voltage sensors? Here we show under a variety of conditions that the function of a voltage-dependent K+ channel is dependent on the negatively charged phosphodiester of phospholipid molecules. A non-voltage-dependent K+ channel does not exhibit the same dependence. The data lead us to propose that the phospholipid membrane, by providing stabilizing interactions between positively charged voltage-sensor arginine residues and negatively charged lipid phosphodiester groups, provides an appropriate environment for the energetic stability and operation of the voltage-sensing machinery. We suggest that the usage of arginine residues in voltage sensors is an adaptation to the phospholipid composition of cell membranes.

Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors.

Les cellules communiquent avec leur environnement externe par le biais de processus physiques et chimiques qui se produisent dans la membrane qui entoure les cellules. La membrane est une barri&egrave;re, mais aussi un environnement particulier dans lequel les prot&eacute;ines membranaires sont capables de mener des processus importants. Certaines prot&eacute;ines membranaires ont la capacit&eacute; de d&eacute;tecter la tension de la membrane et de r&eacute;glementer la conduction ionique ou l&#39;activit&eacute; enzymatique. Ces processus de voltage-d&eacute;pendants s&#39;appuient sur les mesures de domaines de prot&eacute;ines appel&eacute;s capteurs de tension, qui sont int&eacute;gr&eacute;es &agrave; l&#39;int&eacute;rieur de la membrane cellulaire et contiennent un exc&egrave;s d&#39;acides amin&eacute;s charg&eacute;s positivement, qui r&eacute;agissent &agrave; un champ &eacute;lectrique. Comment la membrane cr&eacute;e un environnement adapt&eacute; aux capteurs de tension ? Ici, nous montrons dans une vari&eacute;t&eacute; de conditions que la fonction d&#39;un canal K + voltage-d&eacute;pendants d&eacute;pend de la phosphodiester n&eacute;gativement charg&eacute; des mol&eacute;cules de phospholipides. Un canal K + non voltage-d&eacute;pendant ne pr&eacute;sente pas la m&ecirc;me d&eacute;pendance. Les donn&eacute;es nous conduisent &agrave; proposer que la membrane phospholipidique, en fournissant des interactions stabilisantes entre positivement charg&eacute;es de tension-capteur r&eacute;sidus arginine et n&eacute;gativement charg&eacute; des groupes de phosphodiester lipidique, fournit un environnement appropri&eacute; pour la stabilit&eacute; &eacute;nerg&eacute;tique et le fonctionnement de l&#39;appareil de d&eacute;tection de tension. Nous croyons que l&#39;utilisation de r&eacute;sidus d&#39;arginine dans les capteurs de tension est une adaptation de la composition des phospholipides des membranes cellulaires.

Phospholipides et l&#39;origine des accusations de blocage cationiques dans les capteurs de tension.

Le cellule comunicano con l&#39;ambiente esterno attraverso processi fisici e chimici che avvengono nella membrana delle cellule circostanti. La membrana serve come una barriera cos&igrave; come un ambiente speciale in cui le proteine di membrana sono in grado di effettuare importanti processi. Alcune proteine di membrana hanno la capacit&agrave; di rilevare la tensione di membrana e regolano la conduzione ionica o attivit&agrave; dell&#39;enzima. Tali processi di voltaggio-dipendenti si basano sull&#39;azione di domini della proteina conosciuta come sensori di tensione, che sono incorporati all&#39;interno della membrana delle cellule e che contengono un eccesso di amminoacidi carichi positivamente, che reagiscono a un campo elettrico. Come la membrana crea un ambiente adatto per i sensori di tensione? Qui vi mostriamo sotto una variet&agrave; di condizioni che la funzione di un canale K + voltaggio-dipendenti &egrave; dipendente la fosfodiestere negativamente caricato di molecole fosfolipidiche. Un canale K + non-voltaggio-dipendente non mostrano la stessa dipendenza. I dati ci portano a proporre che la membrana di fosfolipidi, fornendo positivamente stabilizzante interazioni tra residui di arginina sensore di tensione di carica e negativamente caricato gruppi fosfodiestere lipidico, fornisce un ambiente appropriato per l&#39;energico stabilit&agrave; e funzionamento della macchina, rilevazione della tensione. Suggeriamo che l&#39;utilizzo dei residui di arginina nei sensori di tensione &egrave; un adattamento per la composizione di fosfolipidi delle membrane cellulari.

Fosfolipidi e l&#39;origine delle accuse di controllo cationiche in sensori di tensione.

Seipin is a transmembrane protein that resides in the endoplasmic reticulum and concentrates at junctions between the ER and cytosolic lipid droplets. Mutations in the human seipin gene, including the missense mutation A212P, lead to congenital generalized lipodystrophy (CGL), characterized by the lack of normal adipose tissue and accumulation of fat in liver and muscles. In both yeast and CGL patient fibroblasts, seipin is required for normal lipid droplet morphology; in its absence droplets appear to bud abnormally from the ER. Here we report the first purification and physical characterization of seipin. Yeast seipin is in a large discrete protein complex. Affinity purification demonstrated that seipin is the main if not exclusive protein in the complex. Detergent sucrose gradients in H(2)O, and D(2)O and gel filtration were used to determine the size of the seipin complex and account for detergent binding. Both seipin-myc13 (seipin fused to 13 tandem copies of the myc epitope) expressed from the endogenous promoter and overexpressed seipin-mCherry form âˆ¼500 kDa proteins consisting of about 9 copies of seipin. The yeast orthologue of the human A212P allele forms only smaller complexes and is unstable; we hypothesize that this accounts for its null phenotype in humans. Seipin appears as a toroid by negative staining electron microscopy. We speculate that seipin plays at least a structural role in organizing droplets or in communication between droplets and ER.

Seipin is a discrete homooligomer.

Seipine est une prot&eacute;ine transmembranaire qui r&eacute;side dans le r&eacute;ticulum endoplasmique et se concentre au niveau des jonctions entre l&#39;ER et les gouttelettes lipidiques cytosolique. Des mutations dans le g&egrave;ne humain seipine, y compris la mutation faux-sens A212P, conduisent &agrave; des lipodystrophie g&eacute;n&eacute;ralis&eacute;e cong&eacute;nitale (CGL), caract&eacute;ris&eacute;e par l&#39;absence de tissu adipeux normal et l&#39;accumulation de graisse dans le foie et les muscles. Chez les levures et les patients fibroblastes CGL, seipine est requis pour la morphologie gouttelette lipidique normal ; en son absence, gouttelettes apparaissent &agrave; bourgeonner anormalement de l&#39;ER. Nous pr&eacute;sentons la premi&egrave;re purification et caract&eacute;risation physique des seipine. Levure seipine est dans un grande complexe de prot&eacute;ines discr&egrave;te. Purification d&#39;affinit&eacute; ont d&eacute;montr&eacute; que seipine est le principal si la prot&eacute;ine non exclusif dans le complexe. Gradients de sucrose d&eacute;tergent H (2) O et D (2) O et filtration sur gel ont servi &agrave; d&eacute;terminer la taille de la seipine complexe et compte pour la liaison de d&eacute;tergent. Les deux seipine-myc13 (seipine fondue &agrave; 13 copies en tandem de l&#39;&eacute;pitope myc) exprim&eacute; du promoteur endog&egrave;ne et surexprim&eacute;e seipine-mCherry forme 500 kDa prot&eacute;ines constitu&eacute;es d&#39;environ 9 exemplaires de seipine. L&#39;orthologue de la levure de l&#39;all&egrave;le A212P humaine forme des complexes mais plus petites et est instable ; nous &eacute;mettons l&#39;hypoth&egrave;se que ce qui repr&eacute;sente son ph&eacute;notype null chez l&#39;homme. Seipine appara&icirc;t comme un tore par microscopie &eacute;lectronique &agrave; coloration n&eacute;gative. Nous sp&eacute;culons que seipine joue au moins un r&ocirc;le structurant dans l&#39;organisation de gouttelettes ou de communication entre les gouttelettes et ER.

Seipine est un homooligomer discret.

Seipina &egrave; una proteina transmembrana che risiede nel reticolo endoplasmatico e si concentra nelle giunzioni tra ER e goccioline di lipidi citosolici. Mutazioni nel gene umano seipina, tra cui la mutazione missenso A212P, portano a lipodistrofia generalizzata (CGL), caratterizzata dalla mancanza di normale tessuto adiposo e accumulo di grasso nel fegato e nei muscoli. Nel lievito e nei fibroblasti di pazienti CGL seipina &egrave; richiesto per morfologia gocciolina lipidica normale; in sua assenza goccioline sembrano bud anormalmente da ER. Qui riportiamo la prima purificazione e caratterizzazione fisica di seipina. Lievito seipina &egrave; in un grande complesso proteico discreto. Purificazione di affinit&agrave; hanno dimostrato che seipina &egrave; il principale se non esclusiva della proteina nel complesso. Gradienti di saccarosio detergente H (2) O, e D (2) O gel filtrazione sono stati utilizzati per determinare le dimensioni della seipina complesso e rappresentano per l&#39;associazione detergente. Entrambi seipina-myc13 (seipina fuso a 13 copie tandem l&#39;epitopo myc) espresso dal promotore endogeno e overexpressed seipina-mCherry forma &sim;500 kDa proteine costituito da circa 9 copie di seipina. Il lievito orthologue dell&#39;allele A212P umana forma solo piccoli complessi ed &egrave; instabile; Ipotizziamo che questo rappresenta il suo fenotipo null in esseri umani. Seipina appare come un toroide di microscopia elettronica di colorazione negativa. Si ipotizzano che seipina almeno un ruolo strutturale nell&#39;organizzazione di goccioline o nella comunicazione tra goccioline ed ER.

Seipina &egrave; un discreto homooligomer.

Recent studies hypothesized that phospholipids stabilize two voltage-sensing arginine residues of certain voltage-gated potassium channels in activated conformations. It remains unclear how lipids directly affect these channels. Here, by examining the conformations of the KvAP in different lipids, we showed that without voltage change, the voltage-sensor domains switched from the activated to the resting state when their surrounding lipids were changed from phospholipids to nonphospholipids. Such lipid-determined conformational change was coupled to the ion-conducting pore, suggesting that parallel to voltage gating, the channel is gated by its annular lipids. Our measurements recognized that the energetic cost of lipid-dependent gating approaches that of voltage gating, but kinetically it appears much slower. Our data support that a channel and its surrounding lipids together constitute a functional unit, and natural nonphospholipids such as cholesterol should exert strong effects on voltage-gated channels. Our first observation of lipid-dependent gating may have general implications to other membrane proteins.

Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel.

Des &eacute;tudes r&eacute;centes, l&#39;hypoth&egrave;se que les phospholipides stabilisent deux r&eacute;sidus d&#39;arginine-d&eacute;tection de tension de certains canaux potassium voltage-d&eacute;pendants dans les conformations activ&eacute;es. On ignore comment les lipides touchent directement ces canaux. Ici, en examinant les conformations de la KvAP dans les diff&eacute;rents lipides, nous a montr&eacute; que sans tension changer, les domaines de tension-capteur commutent de l&#39;activ&eacute; &agrave; l&#39;&eacute;tat de repos lorsque leurs lipides environnantes ont &eacute;t&eacute; chang&eacute;s de phospholipides &agrave; nonphospholipids. Tel changement conformationnel lipide-d&eacute;termin&eacute; est coupl&eacute;e &agrave; la pore conducteurs d&#39;ions, ce qui sugg&egrave;re que parall&egrave;lement &agrave; la tension de d&eacute;clenchement, le canal est ferm&eacute; de ses lipides annulaires. Nos mesures a reconnu que le co&ucirc;t &eacute;nerg&eacute;tique des lipides d&eacute;pendante bloquant celui de tension Gate, mais cin&eacute;tiquement il semble beaucoup plus lent. Nos donn&eacute;es confirment qu&#39;un canal et ses lipides environnants ensemble constituent une unit&eacute; fonctionnelle et nonphospholipids naturels comme le cholest&eacute;rol doivent exercer des effets importants sur les canaux voltage-d&eacute;pendants. Notre premi&egrave;re observation de lipides d&eacute;pendante bloquant peut avoir des implications g&eacute;n&eacute;rales d&#39;autres prot&eacute;ines de la membrane.

Lipides d&eacute;pendante blocage d&#39;un canal de potassium voltage-d&eacute;pendant.

Recenti studi ipotizzarono che i fosfolipidi stabilizzano due rilevazione tensione residui di arginina di alcuni canali del potassio voltaggio-dipendenti in conformazioni attivati. Rimane poco chiaro come lipidi influenzano direttamente questi canali. Qui, esaminando le conformazioni di KvAP in diversi lipidi, abbiamo dimostrato che senza tensione cambia, i domini di sensore di voltaggio acceso dall&#39;attivato per lo stato di riposo quando loro lipidi circostanti sono stati cambiati da fosfolipidi di nonphospholipids. Tale cambiamento conformazionale lipido-determinato &egrave; stato accoppiato per il conduzione di ioni poro, suggerendo che parallelo alla tensione di gating, il canale &egrave; recintato da suoi lipidi anulare. Le nostre misurazioni riconosciuto che il costo energetico del lipido-dipendente gating si avvicina a quello della tensione di Gate, ma cineticamente appare molto pi&ugrave; lento. I nostri dati supportano un canale e la circostante lipidi insieme costituiscono un&#39;unit&agrave; funzionale, che nonphospholipids naturale come il colesterolo dovrebbe esercitare forti effetti sui canali voltaggio-dipendenti. La nostra prima osservazione di gating lipido-dipendente pu&ograve; avere implicazioni generali di altre proteine di membrana.

Lipido-dipendente gating di un canale del potassio voltaggio-dipendenti.

Neuronal Munc18-1 and members of the Sec1/Munc18 (SM) protein family play a critical function(s) in intracellular membrane fusion together with SNARE proteins, but the mechanism of action of SM proteins remains highly enigmatic. During experiments designed to address this question employing a 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD) fluorescence de-quenching assay that is widely used to study lipid mixing between reconstituted proteoliposomes, we observed that Munc18-1 from squid (sMunc18-1) was able to increase the apparent NBD fluorescence emission intensity even in the absence of SNARE proteins. Fluorescence emission scans and dynamic light scattering experiments show that this phenomenon arises at least in part from increased light scattering due to sMunc18-1-induced liposome clustering. Nuclear magnetic resonance and circular dichroism data suggest that, although native sMunc18-1 does not bind significantly to lipids, sMunc18-1 denaturation at 37 Â°C leads to insertion into membranes. The liposome clustering activity of sMunc18-1 can thus be attributed to its ability to bridge two membranes upon (perhaps partial) denaturation; correspondingly, this activity is hindered by addition of glycerol. Cryo-electron microscopy shows that liposome clusters induced by sMunc18-1 include extended interfaces where the bilayers of two liposomes come into very close proximity, and clear hemifusion diaphragms. Although the physiological relevance of our results is uncertain, they emphasize the necessity of complementing fluorescence de-quenching assays with alternative experiments in studies of membrane fusion, as well as the importance of considering the potential effects of protein denaturation. In addition, our data suggest a novel mechanism of membrane hemifusion induced by amphipathic macromolecules that does not involve formation of a stalk intermediate.

Membrane bridging and hemifusion by denaturated Munc18.

Neuronale Munc18-1 et les membres de la famille de prot&eacute;ine Sec1/Munc18 (SM) jouent une ou plusieurs fonctions essentielle dans la fusion membranaire intracellulaire avec prot&eacute;ines SNARE, mais le m&eacute;canisme d&#39;action des prot&eacute;ines SM reste tr&egrave;s &eacute;nigmatique. Au cours d&#39;exp&eacute;riences con&ccedil;ues pour r&eacute;pondre &agrave; cette question en employant une fluorescence (NBD) 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole, de-quenching de dosage qui est largement utilis&eacute; pour &eacute;tudier les lipides m&eacute;lange entre prot&eacute;oliposomes reconstitu&eacute;s, nous avons observ&eacute; que Munc18-1 de calmars (sMunc18-1) a &eacute;t&eacute; en mesure d&#39;augmenter l&#39;intensit&eacute; apparente de d&#39;&eacute;mission de fluorescence de NBD m&ecirc;me en l&#39;absence des prot&eacute;ines SNARE. Analyses d&#39;&eacute;mission de fluorescence et diffusion de spectacle d&#39;exp&eacute;riences que ce ph&eacute;nom&egrave;ne d&eacute;coule en partie du moins de diffusion accrue de la lumi&egrave;re en raison de clustering de liposome induite par le sMunc18-1 de la lumi&egrave;re dynamique. Donn&eacute;es de dichro&iuml;sme circulaire et de r&eacute;sonance magn&eacute;tique nucl&eacute;aire sugg&egrave;rent que, bien que native sMunc18-1 ne se lie pas significativement aux lipides, d&eacute;naturation de la sMunc18-1 &agrave; 37 &deg; C conduit &agrave; l&#39;insertion dans les membranes. L&#39;activit&eacute; de gestion de clusters liposome de sMunc18-1 peut donc &ecirc;tre attribu&eacute;e &agrave; sa capacit&eacute; &agrave; combler les deux membranes sur la d&eacute;naturation (peut-&ecirc;tre partielle) ; Parall&egrave;lement, cette activit&eacute; est entrav&eacute;e par l&#39;addition de glyc&eacute;rol. Cryo-microscopie &eacute;lectronique montre que grappes de liposome induites par sMunc18-1 incluent les interfaces &eacute;tendues o&ugrave; les bicouches de deux liposomes entrent en tr&egrave;s grande proximit&eacute; et effacer des membranes hemifusion. Bien que la pertinence physiologique de nos r&eacute;sultats est incertaine, ils mettent l&#39;accent sur la n&eacute;cessit&eacute; de compl&eacute;ter la fluorescence de-quenching des essais avec des exp&eacute;riences alternatives dans les &eacute;tudes de fusion membranaire, ainsi que l&#39;importance d&#39;examiner les effets potentiels de la d&eacute;naturation des prot&eacute;ines. En outre, nos donn&eacute;es indiquent un nouveau m&eacute;canisme de hemifusion de membrane induite par des macromol&eacute;cules d&#39;amphipathic qui n&#39;implique pas la formation d&#39;une tige interm&eacute;diaire.

Membrane de pontage et hemifusion par d&eacute;natur&eacute;es Munc18.

Neuronale Munc18-1 e membri della famiglia della proteina Sec1/Munc18 (SM) svolgono una funzione critica nella fusione di membrana intracellulare con le proteine SNARE, ma il meccanismo d&#39;azione delle proteine SM rimane altamente enigmatico. Durante gli esperimenti progettati per affrontare questa questione che impiegano una fluorescenza (NBD) 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole de-quenching saggio che &egrave; ampiamente usato per studiare i lipidi miscelazione tra proteoliposomes ricostituito, abbiamo osservato che Munc18-1 da squid (sMunc18-1) era in grado di aumentare l&#39;intensit&agrave; di emissione di fluorescenza NBD evidente anche in assenza delle proteine SNARE. Scansioni di emissione di fluorescenza e dynamic light scattering esperimenti mostrano che questo fenomeno si pone almeno in parte dalla maggiore diffusione della luce a causa di sMunc18-1-induced liposoma clustering. Risonanza magnetica nucleare e Dicroismo circolare dati suggeriscono che, sebbene nativo sMunc18-1 non legano significativamente a lipidi, sMunc18-1 denaturazione a 37 &deg; C porta a inserimento nelle membrane. L&#39;attivit&agrave; di clustering liposoma di sMunc18-1 cos&igrave; pu&ograve; essere attribuito alla sua capacit&agrave; di colmare due membrane dopo denaturazione (forse parziale); corrispondentemente, questa attivit&agrave; &egrave; ostacolata dall&#39;aggiunta di glicerolo. Crio-microscopia elettronica dimostra che il cluster liposoma indotto da sMunc18-1 includono interfacce estese dove il bilayer di due liposomi entrano nelle immediate vicinanze e chiaro hemifusion diaframmi. Sebbene la rilevanza fisiologica dei nostri risultati &egrave; incerta, sottolineano la necessit&agrave; di integrare la fluorescenza de-quenching dosaggi con esperimenti alternativi in studi di fusione della membrana, nonch&eacute; l&#39;importanza di considerare i potenziali effetti di denaturazione proteica. Inoltre, i nostri dati suggeriscono un meccanismo romanzo di hemifusion membrana indotta da macromolecole amphipathic che non comporta la formazione di un intermedio di gambo.

Membrana bridging e hemifusion da cloroderivati Munc18.

In response to viral infection, RIG-I-like RNA helicases bind to viral RNA and activate the mitochondrial protein MAVS, which in turn activates the transcription factors IRF3 and NF-ÎºB to induce type I interferons. [corrected] We have previously shown that RIG-I binds to unanchored lysine-63 (K63) polyubiquitin chains and that this binding is important for MAVS activation; however, the mechanism underlying MAVS activation is not understood. Here, we show that viral infection induces the formation of very large MAVS aggregates, which potently activate IRF3 in the cytosol. We find that a fraction of recombinant MAVS protein forms fibrils that are capable of activating IRF3. Remarkably, the MAVS fibrils behave like prions and effectively convert endogenous MAVS into functional aggregates. We also show that, in the presence of K63 ubiquitin chains, RIG-I catalyzes the conversion of MAVS on the mitochondrial membrane to prion-like aggregates. These results suggest that a prion-like conformational switch of MAVS activates and propagates the antiviral signaling cascade.

MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.

En r&eacute;ponse &agrave; une infection virale, RIG-I-like RNA helicases se lient &agrave; l&#39;ARN viral et activer la prot&eacute;ine mitochondriale MAVS, qui &agrave; son tour active les facteurs de transcription IRF3 et NF-&kappa;B pour induire interf&eacute;rons de type I. [corrig&eacute;] Nous avons d&eacute;j&agrave; montr&eacute; ce gr&eacute;ement-je lie &agrave; cha&icirc;nes de polyubiquitine sans ancrage lysine-63 (K63) et que cette liaison est importante pour l&#39;activation des MAVS ; Toutefois, l&#39;activation m&eacute;canisme MAVS sous-jacent n&#39;est pas comprise. Ici, nous montrons que l&#39;infection virale induit la formation de tr&egrave;s grands agr&eacute;gats MAVS, qui a fortement activer IRF3 dans le cytosol. Nous trouvons qu&#39;une fraction de fibrilles de formes de prot&eacute;ine MAVS recombinants qui sont capables d&#39;activer IRF3. Remarquablement, les fibrilles MAVS se comportent comme des prions et convertissent efficacement les MAVS endog&egrave;nes en agr&eacute;gats fonctionnelles. Nous montrons &eacute;galement que, en pr&eacute;sence de cha&icirc;nes d&#39;ubiquitine K63, RIG-je catalyse la conversion des MAVS sur la membrane mitochondriale &agrave; prion comme agr&eacute;gats. Ces r&eacute;sultats sugg&egrave;rent qu&#39;un commutateur de type prion conformationnels des MAVS active et propage l&#39;antiviral cascade de signalisation.

MAVS forme fonctionnelles prion comme agr&eacute;gats pour activer et propager des antiviraux r&eacute;ponse immunitaire inn&eacute;e.

In risposta all&#39;infezione virale, RIG-io-come RNA elicasi legano al RNA virale e attivare la proteina mitocondriale MAVS, che a sua volta attiva i fattori di trascrizione IRF3 e NF-&kappa;B per indurre gli interferoni di tipo I. [correzione] Abbiamo precedentemente dimostrato che RIG-si lega al inflazionistiche lisina-63 (K63) catene polyubiquitin e che questa associazione &egrave; importante per l&#39;attivazione del MAV; Tuttavia, l&#39;attivazione di MAVS meccanismo sottostante non &egrave; capito. Qui, ci mostrano che l&#39;infezione virale induce la formazione di grandi aggregati MAVS, che attivare potentemente IRF3 nel citosol. Riteniamo che una frazione di fibrille di forme ricombinante da MAVS proteine che sono in grado di attivare IRF3. Notevolmente, le fibrille MAVS si comportano come i prioni e convertono efficacemente MAVS endogeno in aggregazioni funzionali. Ci mostrano anche che, in presenza di catene di ubiquitina K63, RIG-catalizza la conversione del MAVS sulla membrana mitocondriale di aggregati di prion-like. Questi risultati suggeriscono che un prione-come interruttore conformazionali dei MAVS si attiva e si propaga l&#39;antivirale cascata di segnalazione.

MAVS forme funzionali da prioni-come aggregati per attivare e propagare la risposta immunitaria innata antivirale.

Structural insights into the activation of RIG-I, a nanosensor for viral RNAs.

Aper&ccedil;us structurelles de l&#39;activation du RIG-je, un NANOCAPTEUR pour l&#39;ARN viral.

Intuizioni strutturali l&#39;attivazione di RIG-I, un nanosensore per RNAs virale.

Cells are organized on length scales ranging from Ã¥ngstrÃ¶m to micrometres. However, the mechanisms by which Ã¥ngstrÃ¶m-scale molecular properties are translated to micrometre-scale macroscopic properties are not well understood. Here we show that interactions between diverse synthetic, multivalent macromolecules (including multi-domain proteins and RNA) produce sharp liquid-liquid-demixing phase separations, generating micrometre-sized liquid droplets in aqueous solution. This macroscopic transition corresponds to a molecular transition between small complexes and large, dynamic supramolecular polymers. The concentrations needed for phase transition are directly related to the valency of the interacting species. In the case of the actin-regulatory protein called neural Wiskott-Aldrich syndrome protein (N-WASP) interacting with its established biological partners NCK and phosphorylated nephrin, the phase transition corresponds to a sharp increase in activity towards an actin nucleation factor, the Arp2/3 complex. The transition is governed by the degree of phosphorylation of nephrin, explaining how this property of the system can be controlled to regulatory effect by kinases. The widespread occurrence of multivalent systems suggests that phase transitions may be used to spatially organize and biochemically regulate information throughout biology.

Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins.

Les cellules sont organis&eacute;es sur des &eacute;chelles de longueur allant d&#39;&aring;ngstr&ouml;m et microm&egrave;tres. Cependant, les m&eacute;canismes par lequel &aring;ngstr&ouml;m-&eacute;chelle propri&eacute;t&eacute;s mol&eacute;culaires sont converties en propri&eacute;t&eacute;s macroscopiques &agrave; l&#39;&eacute;chelle du microm&egrave;tre ne sont pas bien compris. Ici, nous montrons que les interactions entre diverses macromol&eacute;cules synth&eacute;tiques, multivalents (y compris les ARN et les prot&eacute;ines multi-domaine) produisent forte s&eacute;parations de phase liquide-liquide-d&eacute;mixion, g&eacute;n&eacute;rant des microm&egrave;tres taille des gouttelettes de liquide en solution aqueuse. Cette transition macroscopique correspond &agrave; une transition mol&eacute;culaire entre les complexes de petites et grandes, dynamiques des polym&egrave;res supramol&eacute;culaires. Les concentrations n&eacute;cessaires pour la transition de phase sont directement li&eacute;es &agrave; la Valence de l&#39;esp&egrave;ce qui interagissent. Dans le cas de l&#39;actine-r&eacute;glementation prot&eacute;ines appel&eacute;es prot&eacute;ines neuronales Wiskott - Aldrich, syndrome (N-WASP) en interaction avec ses partenaires biologiques &eacute;tablis NCK et n&eacute;phrine phosphoryl&eacute;e, la transition de phase correspond &agrave; une forte augmentation dans l&#39;activit&eacute; &agrave; l&#39;&eacute;gard d&#39;un facteur de nucl&eacute;ation de l&#39;actine, le complexe Arp2/3. La transition est r&eacute;gie par le degr&eacute; de phosphorylation de n&eacute;phrine, expliquant comment cette propri&eacute;t&eacute; du syst&egrave;me peut &ecirc;tre contr&ocirc;l&eacute;e &agrave; effet r&eacute;gulateur par des kinases. La pr&eacute;sence r&eacute;pandue de syst&egrave;mes multivalents sugg&egrave;re que les transitions de phase peuvent servir &agrave; organiser dans l&#39;espace et biochimiquement r&eacute;glementer les informations tout au long de la biologie.

Transitions de phase dans l&#39;assemblage des prot&eacute;ines de signalisation multivalents.

Le cellule sono organizzate su scale di lunghezza che vanno dal &aring;ngstr&ouml;m di micrometri. Tuttavia, i meccanismi da cui &aring;ngstr&ouml;m-scala molecolare propriet&agrave; vengono convertite in propriet&agrave; macroscopiche su scala micrometrica non sono ben compresi. Qui vi mostriamo che le interazioni tra diverse macromolecole sintetiche, polivalente (tra cui il RNA e proteine multidominio) producano taglienti separazioni di fase liquido-liquido-demixing, generando micrometri-dimensioni delle gocce liquide in soluzione acquosa. Questa transizione macroscopica corrisponde ad una transizione molecolare tra complessi di piccole e grandi, dinamiche polimeri supramolecolare. Le concentrazioni necessarie per la fase di transizione sono direttamente correlate alla valenza della specie interagenti. Nel caso della proteina actina-normativa chiamata proteina neurale Wiskott - Aldrich-Syndroms (N-WASP) interagendo con il suo partner biologico stabilito NCK e fosforilata Nefrina, la transizione di fase corrisponde a un forte incremento nelle attivit&agrave; verso un fattore di nucleazione di actina, il complesso Arp2/3. Il passaggio &egrave; regolato dal grado di fosforilazione della Nefrina, spiegando come questa propriet&agrave; del sistema pu&ograve; essere controllata a effetto normativo da chinasi. Occorrenza diffusa dei sistemi plurivalenti suggerisce che le transizioni di fase possono essere utilizzate per organizzare spazialmente e biochimicamente regolare informazioni nel corso di biologia.

Transizioni di fase nell&#39;Assemblea delle proteine di segnalazione polivalente.

Voltage-gated ion channels are responsible for transmitting electrochemical signals in both excitable and non-excitable cells. Structural studies of voltage-gated potassium and sodium channels by X-ray crystallography have revealed atomic details on their voltage-sensor domains (VSDs) and pore domains, and were put in context of disparate mechanistic views on the voltage-driven conformational changes in these proteins. Functional investigation of voltage-gated channels in membranes, however, showcased a mechanism of lipid-dependent gating for voltage-gated channels, suggesting that the lipids play an indispensible and critical role in the proper gating of many of these channels. Structure determination of membrane-embedded voltage-gated ion channels appears to be the next frontier in fully addressing the mechanism by which the VSDs control channel opening. Currently electron crystallography is the only structural biology method in which a membrane protein of interest is crystallized within a complete lipid-bilayer mimicking the native environment of a biological membrane. At a sufficiently high resolution, an electron crystallographic structure could reveal lipids, the channel and their mutual interactions at the atomic level. Electron crystallography is therefore a promising avenue toward understanding how lipids modulate channel activation through close association with the VSDs.

The influence of lipids on voltage-gated ion channels.

Canaux ioniques voltage-d&eacute;pendants est responsables de la transmission de signaux &eacute;lectrochimiques dans les cellules excitables et non-excitables. &Eacute;tudes structurales de potassium voltage-d&eacute;pendant et les canaux de sodium par cristallographie aux rayons x ont r&eacute;v&eacute;l&eacute; des d&eacute;tails atomiques sur leurs domaines de tension-capteur (VV) et domaines de pores et ont &eacute;t&eacute; mises en contexte de disparates vues m&eacute;canistes sur les changements de conformation ax&eacute;e sur la tension dans ces prot&eacute;ines. Enqu&ecirc;te fonctionnelle des canaux voltage-d&eacute;pendants dans les membranes, toutefois, un m&eacute;canisme de lipides d&eacute;pendante bloquant pour les canaux voltage-d&eacute;pendants, ce qui sugg&egrave;re que les lipides jouent un r&ocirc;le indispensable et essentiel &agrave; la bonne blocage d&#39;un grand nombre de ces canaux en d&eacute;monstration. D&eacute;termination de la structure des canaux ioniques de voltage-d&eacute;pendant int&eacute;gr&eacute;e &agrave; la membrane semble &ecirc;tre l&#39;&eacute;tape suivante d&#39;enti&egrave;rement aborder le m&eacute;canisme par lequel le canal de commande actuels d&#39;ouverture. Cristallographie d&#39;&eacute;lectron est actuellement la m&eacute;thode de biologie structurale seulement dans laquelle une prot&eacute;ine de membrane d&#39;int&eacute;r&ecirc;t est r&eacute;sum&eacute;e dans une couche-lipidique complet imitant l&#39;environnement natif d&#39;une membrane biologique. Avec une r&eacute;solution suffisamment &eacute;lev&eacute;e, une structure cristallographique de l&#39;&eacute;lectron pourrait r&eacute;v&eacute;ler des lipides, de la Manche et de leurs interactions au niveau atomique. Cristallographie d&#39;&eacute;lectron est donc une voie prometteuse pour comprendre comment lipides modulent l&#39;activation du canal par le biais de liaison &eacute;troite avec le VV.

L&#39;influence des lipides sur les canaux ioniques voltage-d&eacute;pendants.

Canali ionici voltaggio-dipendenti sono responsabili per la trasmissione di segnali elettrochimici nelle cellule eccitabili sia non eccitabili. Studi strutturali di potassio voltaggio-dipendenti e i canali del sodio di cristallografia a raggi x hanno rivelato dettagli atomici sui loro domini di sensore di voltaggio (VSD) e poro domini e sono stati messi in un contesto di disparate opinioni meccanicistiche sui cambiamenti conformazionali tensione-driven in queste proteine. Indagine funzionale dei canali voltaggio-dipendenti nelle membrane, tuttavia, ha presentato un meccanismo del lipido-dipendente gating per canali voltaggio-dipendenti, suggerendo che i lipidi svolgono un ruolo indispensabile e fondamentale la corretta gating di molti di questi canali. Determinazione della struttura dei canali ionici voltaggio-dipendenti incorporati membrana sembra essere la prossima frontiera completamente affrontare il meccanismo mediante il quale il canale di controllo VSD apertura. Cristallografia di elettrone &egrave; attualmente il metodo di biologia strutturale solo in cui una proteina di membrana di interesse &egrave; cristallizzata all&#39;interno del doppio un completo-strato lipidico che mimano l&#39;ambiente nativo di una membrana biologica. A una risoluzione sufficientemente alta, una struttura cristallografica elettrone potrebbe rivelare lipidi, il canale e le loro interazioni reciproche a livello atomico. Cristallografia di elettrone &egrave; pertanto un promettente avenue verso la comprensione come lipidi modulano attivazione canale attraverso la stretta associazione con il VSD.

L&#39;influenza dei lipidi su canali ionici voltaggio-dipendenti.

Voltage-gated ion channels support electrochemical activity in cells and are largely responsible for information flow throughout the nervous systems. The voltage sensor domains in these channels sense changes in transmembrane potential and control ion flux across membranes. The X-ray structures of a few voltage-gated ion channels in detergents have been determined and have revealed clear structural variations among their respective voltage sensor domains. More recent studies demonstrated that lipids around a voltage-gated channel could directly alter its conformational state in membrane. Because of these disparities, the structural basis for voltage sensing in native membranes remains elusive. Here, through electron-crystallographic analysis of membrane-embedded proteins, we present the detailed view of a voltage-gated potassium channel in its inactivated state. Contrary to all known structures of voltage-gated ion channels in detergents, our data revealed a unique conformation in which the four voltage sensor domains of a voltage-gated potassium channel from Aeropyrum pernix (KvAP) form a ring structure that completely surrounds the pore domain of the channel. Such a structure is named the voltage sensor ring. Our biochemical and electrophysiological studies support that the voltage sensor ring represents a physiological conformation. These data together suggest that lipids exert strong effects on the channel structure and that these effects may be changed upon membrane disruption. Our results have wide implications for lipid-protein interactions in general and for the mechanism of voltage sensing in particular.

Voltage sensor ring in a native structure of a membrane-embedded potassium channel.

Canaux ioniques voltage-d&eacute;pendants, soutenir l&#39;activit&eacute; &eacute;lectrochimique dans les cellules et est largement responsables de la circulation de l&#39;information dans tout le syst&egrave;me nerveux. Les domaines de capteur de tension dans ces changements de sens de canaux en flux ionique transmembranaire &agrave; potentiel et contr&ocirc;le &agrave; travers les membranes. Les structures des quelques canaux ioniques voltage-d&eacute;pendants dans les d&eacute;tergents ont &eacute;t&eacute; d&eacute;termin&eacute;s et ont r&eacute;v&eacute;l&eacute; des variations clair structure parmi leurs domaines de capteur de tension respectives. Des &eacute;tudes plus r&eacute;centes ont d&eacute;montr&eacute; que les lipides autour d&#39;un canal de voltage-d&eacute;pendants pouvaient modifier directement son &eacute;tat conformationnel dans la membrane. &Agrave; cause de ces disparit&eacute;s, la base structurelle pour la d&eacute;tection dans les membranes natifs de tension reste insaisissable. Gr&acirc;ce &agrave; l&#39;analyse cristallographique-&eacute;lectron de prot&eacute;ines membranaires incorpor&eacute;s, nous pr&eacute;sentons ici la vue d&eacute;taill&eacute;e d&#39;un canal de potassium voltage-d&eacute;pendant dans son &eacute;tat inactiv&eacute;. Contrairement aux structures tous connus des canaux ioniques voltage-d&eacute;pendants dans les d&eacute;tergents, nos donn&eacute;es ont r&eacute;v&eacute;l&eacute; une conformation unique dans lequel les domaines de capteur de quatre tension de potassium voltage-d&eacute;pendant du canal de Aeropyrum pernix (KvAP) forme une structure d&#39;anneau qui entoure compl&egrave;tement le domaine pore du canal. Une telle structure est appel&eacute;e l&#39;anneau de capteur de tension. Nos &eacute;tudes biochimiques et &eacute;lectrophysiologiques soutiennent que l&#39;anneau de capteur de tension repr&eacute;sente une conformation physiologique. L&#39;ensemble de ces donn&eacute;es sugg&egrave;rent que les lipides exercent des effets importants sur la structure de la voie et que ces effets peuvent &ecirc;tre chang&eacute;es &agrave; la rupture de la membrane. Nos r&eacute;sultats ont des implications larges pour des interactions de prot&eacute;ine-lipides en g&eacute;n&eacute;ral et pour le m&eacute;canisme de d&eacute;tection de tension en particulier.

Anneau capteur de tension dans une structure native d&#39;un canal potassique &agrave; membrane incorpor&eacute;e.

Canali ionici voltaggio-dipendenti supportano attivit&agrave; elettrochimica nelle cellule e sono in gran parte responsabile per il flusso di informazioni in tutto il sistema nervoso. I domini del sensore di tensione in questi cambiamenti di senso canali transmembrana potenziale e controllo flusso di ioni attraverso le membrane. Le strutture dei raggi x di alcuni canali ionici voltaggio-dipendenti nei detergenti sono state determinate e hanno rivelato chiaro strutturale variazioni tra loro domini sensore tensione rispettivi. Studi pi&ugrave; recenti hanno dimostrato che lipidi intorno un canale voltaggio-dipendente direttamente potrebbero alterare il suo stato conformazionale nella membrana. A causa di queste differenze, le basi strutturali per controllo nelle membrane native di tensione resta sfuggente. Qui, attraverso l&#39;analisi cristallografica elettrone delle proteine di membrana-embedded, vi presentiamo la vista dettagliata di un canale del potassio voltaggio-dipendenti nel suo stato inattivato. Contrariamente a tutti noti strutture dei canali ionici voltaggio-dipendenti nel settore dei detergenti, i nostri dati hanno rivelato una conformazione unica in cui i domini di sensore di quattro tensione di un potassio voltaggio-dipendenti canale da Sulfolobus pernix (KvAP) forma una struttura ad anello che circonda completamente il dominio del poro del canale. Tale struttura &egrave; denominata l&#39;anello del sensore di tensione. I nostri studi elettrofisiologici e biochimici sostengono che l&#39;anello di tensione sensore rappresenta una conformazione fisiologica. Questi dati suggeriscono insieme che lipidi esercitano forti effetti sulla struttura del canale, e che questi effetti possono essere modificati dopo la rottura della membrana. I nostri risultati hanno implicazioni ampie per interazioni lipido-proteina in generale e per il meccanismo di rilevazione di tensione in particolare.

Anello sensore di tensione in una struttura nativa di un canale del potassio incorporato di membrana.

Retraction for Shi et al., "Voltage sensor ring in a native structure of a membrane-embedded potassium channel".

R&eacute;traction pour Shi et al., &laquo; capteur de tension ring dans une structure native d&#39;un canal membranaire int&eacute;gr&eacute; &raquo;.

Retrazione per Shi et al., &quot;sensore di voltaggio anello in una struttura nativa di un canale del potassio incorporato di membrana&quot;.

Defects in normal autophagic pathways are implicated in numerous human diseases-such as neurodegenerative diseases, cancer, and cardiomyopathy-highlighting the importance of autophagy and its proper regulation. Herein we show that Vibrio parahaemolyticus uses the type III effector VopQ (Vibrio outer protein Q) to alter autophagic flux by manipulating the partitioning of small molecules and ions in the lysosome. This effector binds to the conserved Vo domain of the vacuolar-type H(+)-ATPase and causes deacidification of the lysosomes within minutes of entering the host cell. VopQ forms a gated channel âˆ¼18 Ã… in diameter that facilitates outward flux of ions across lipid bilayers. The electrostatic interactions of this type 3 secretion system effector with target membranes dictate its preference for host vacuolar-type H(+)-ATPase-containing membranes, indicating that its pore-forming activity is specific and not promiscuous. As seen with other effectors, VopQ is exploiting a eukaryotic mechanism, in this case manipulating lysosomal homeostasis and autophagic flux through transmembrane permeation.

Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux.

D&eacute;fauts dans les voies normales d&#39;autophagiques jouent un r&ocirc;le dans nombreuses homme de maladies telles les maladies neurod&eacute;g&eacute;n&eacute;ratives, le cancer et cardiomyopathie-en soulignant l&#39;importance de l&#39;autophagie et sa r&eacute;gulation ad&eacute;quate. Nous montrons ici que Vibrio parahaemolyticus utilise l&#39;effecteur III de type VopQ (prot&eacute;ine ext&eacute;rieure de Vibrio Q) pour modifier le flux autophagique en manipulant le cloisonnement des petites mol&eacute;cules et des ions dans le lysosome. Cet effecteur se lie &agrave; la Vo conserv&eacute;e du vacuolaire de type H (+)-ATPase et causes d&eacute;sacidification des lysosomes quelques minutes d&#39;entrer dans la cellule h&ocirc;te. VopQ forme un canal gated &sim;18 &Aring; de diam&egrave;tre qui facilite le flux sortant des ions dans les bicouches lipidiques. Les interactions &eacute;lectrostatiques de cet effecteur de syst&egrave;me de s&eacute;cr&eacute;tion de type 3 avec membranes cible dictent sa pr&eacute;f&eacute;rence pour h&eacute;berger vacuolaire de type H (+)-ATPase-contenant des membranes, indiquant que son activit&eacute; formant des pores est sp&eacute;cifique et pas de promiscuit&eacute;. Comme on le voit avec les autres effecteurs, VopQ exploite un m&eacute;canisme eucaryote, dans ce cas manipuler lysosomal hom&eacute;ostasie et flux autophagique par perm&eacute;ation transmembranaire.

Prot&eacute;ines effectrices de Vibrio, VopQ, forme un canal gated lysosomal qui perturbe l&#39;hom&eacute;ostasie ionique d&#39;h&ocirc;te et le flux autophagie.

Article	Year
Three-dimensional structure of the type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor at 24 A resolution. The EMBO journal\| PubMed ID: 12110570	2002
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Membrane bridging and hemifusion by denaturated Munc18. PloS one\| PubMed ID: 21765933	2011
MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell\| PubMed ID: 21782231	2011
Structural insights into the activation of RIG-I, a nanosensor for viral RNAs. EMBO reports\| PubMed ID: 22157887	2012
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Voltage sensor ring in a native structure of a membrane-embedded potassium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 23401554	2013
Retraction for Shi et al., "Voltage sensor ring in a native structure of a membrane-embedded potassium channel". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 23530252	2013
Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 23798441	2013

Qiu-Xing Jiang

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