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- The Journal of Biological Chemistry
- Biochemistry and Cell Biology = Biochimie Et Biologie Cellulaire
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- Plant Physiology and Biochemistry : PPB / Société Française De Physiologie Végétale
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Articles by Susanne E. Kohalmi in JoVE
JoVE General
Détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire Compatible (BiFC) Système
1Department of Biology, University of Western Ontario, 2Southern Crop Protection and Food Research Centre, Agriculture and Agri-Food Canada
Nous avons développé une technique pour tester les interactions entre protéines dans les plantes. Une protéine fluorescente jaune (YFP) est divisée en deux fragments non-cumul. Chaque fragment est clone dans leur cadre d'un gène d'intérêt par l'intermédiaire du système de passerelle, permettant l'expression de protéines de fusion. Reconstitution du signal YFP ne survient que lorsque les protéines interagissent l'enquête.
Other articles by Susanne E. Kohalmi on PubMed
Mutation De L'allèle Ap2-6 Entraîne La Reconnaissance D'un Site D'épissage Cryptique
Mutations de la homéotiques gène APETALA2 d'Arabidopsis thaliana causent graves altérations du développement, surtout des remplacements d'organes floraux homéotiques de pétales à carpelles et pétales aux étamines à l'extérieurs deux verticilles floraux. A ce jour, dix allèles différents ont été identifiés en conférant des phénotypes de divers degrés. Ces allèles dix, trois seulement ont été caractérisés au niveau de la séquence. L'identification de l'altération de la séquence de l'allèle ap2-6 est rapportée ici. Ap2-6 un seul G.C à Abdel de transition s'est produite à l'extrémité 3' de l'intron 6 (position 1342) qui conduit à une perte de dinucléotide au niveau de l'ARNm. Cette modification est conforme avec le G.C à transition Abdel détruisant un motif conservé dinucléotide (AG) requis pour la reconnaissance de la bonne épissure et la reconnaissance qui en résulte de la dinucléotide d'AG disponible suivante en aval qui est juste à côté du site d'épissage authentique 3' AP2. La perte de dinucléotide provoquera un changement de phase, la traduction de trois acides aminés incorrectes et un codon stop prématuré ayant pour résultat une troncation de la séquence de l'AP2 dans le domaine de l'AP2-R2. Telle une troncature est prédit à influer fortement sur la fonction de l'AP2 et est compatible avec le phénotype observé.
Cytochrome F De La Psychrophile L'Antarctique, Raudensis Chlamydomonas UWO 241: Structure, La Séquence, Et De Complémentarité Dans Le Mésophiles, Chlamydomonas Reinhardtii
Bien que f cytochrome du psychrophile antarctique, Chlamydomonas raudensis UWO 241, présente une masse moléculaire apparente inférieure (34 kD) à celle de la mésophile C.reinhardtii (41 kD) basée sur SDS-PAGE, les deux protéines sont comparables en masse moléculaire calculée et afficher une identité de 79% en séquence d'acides aminés. La différence de masse moléculaire apparente est maintenu après l'expression du petA à partir d'espèces de Chlamydomonas deux dans E. coli soit ou un mutant de Chlamydomonas reinhardtii DeltapetA et après la substitution d'un troisième uniques cystéine-292 en phénylalanine dans le cytochrome f psychrophile. En outre, l'hème de la forme de cytochrome psychrophile f est moins stable lors d'un chauffage à celle de la mésophile. Contrairement à C. raudensis, un C. reinhardtii DeltapetA mutant transformé avec PETA à partir raudensis C. démontré sa capacité à subir des transitions d'état et d'une capacité de transport d'électrons intersystème comparable à celle de C. reinhardtii de type sauvage. Toutefois, le C. reinhardtii petA transformants accumulé des niveaux inférieurs du cytochrome b (6) / f complexes et exposées inférieurs légers saturés taux de O (2) l'évolution de C. reinhardtii de type sauvage. Nous montrons que la présence d'une forme altérée de cytochrome f en raudensis C. ne tient pas compte de son incapacité de se soumettre à des transitions d'état ou de sa diminution de la capacité pour le transport des électrons intersystème comme suggéré précédemment. Une enquête combinée de la masse moléculaire apparente, la stabilité thermique et des séquences d'acides aminés de cytochrome f à partir d'un large éventail d'espèces mésophiles montre sans équivoque que les différences observées dans la structure du cytochrome f ne sont pas liés à psychrophilly. Ainsi, il faut être prudent en rapportant les différences de séquence d'acides aminés et la stabilité thermique à l'adaptation à des environnements froids.
Biosynthèse De Phénylalanine Chez Arabidopsis Thaliana. Identification Et Caractérisation Des Arogénate Peroxysomal
Il y a beaucoup d'incertitude quant à savoir si plantes utilisent arogénate, le phénylpyruvate ou les deux comme des intermédiaires obligatoires dans la biosynthèse de Phe, un aminoacide essentiel alimentaire pour l'homme. C'est parce que les préphénate et arogénate ont été signalés à subir une déshydratation décarboxylante chez les plantes par l'intermédiaire de l'action d'arogénate (ADT) ou préphénate (PDT) déshydratases ; Toutefois, ni enzymes, ni encodage ou des gènes ont été isolés ou caractérisée sur le plan fonctionnel. Un in silico, approche d'extraction de données visait donc à essayer d'identifier les dehydratase(s) impliqués dans la formation de Phe dans Arabidopsis, basé sur la similarité des séquences des domaines Loi-type et PDT en bactéries. Cette approche d'extraction de données suggère qu'il y a six homologues PDT-comme dans le genre Arabidopsis, séparés en trois sous-groupes distincts dont les analyses phylogénétiques. Tous les six gènes ont été clonés et par la suite mis en place pour s'exprimer dans tous les tissus examinés. Chacun a ensuite exprimé comme une protéine recombinante de fusion Nus chez Escherichia coli, avec leurs spécificités de substrat mesurées in vitro. Trois des protéines recombinantes qui en résulte, codées par ADT1 (At1g11790), ADT2 (At3g07630) et ADT6 (At1g08250), utilisé plus efficacement arogénate que préphénate, tandis que les autres trois, ADT3 (At2g27820), ADT4 (At3g44720) et ADT5 (At5g22630) essentiellement seulement employées arogénate. ADT1, ADT2 et ADT6 avaient des valeurs/km k (des entreprises TSAE) de 1050, 7650 et 1560 M(-1) S(-1) pour arogénate contre 38 240 et 16 M(-1) S(-1) pour préphénate, respectivement. En revanche, les autres trois, ADT3, ADT4 et ADT5, avaient valeurs/km k (des entreprises TSAE) de 1140, 490 et 620 M(-1) S(-1), avec préphénate ne pas servir comme substrat à moins que l'excès de protéine recombinante (> 150 microgrammes/test) a été utilisé. Tous les six gènes et leurs protéines correspondantes, sont donc provisoirement classées comme arogénate déshydratases et désignés ADT1-ADT6.
Le Petit Domaine Du Cytochrome F from the Psychrophile Chlamydomonas Raudensis UWO 241 Module La Masse Moléculaire Apparente Et Diminue L'accumulation De Cytochrome F Dans Le Mesophile Chlamydomonas Reinhardtii
Cytochrome f from the psychrophile Chlamydomonas raudensis UWO 241 a une thermostabilité inférieure de l'hème de type c et une masse moléculaire apparente qui est inférieur à celui de l'algue verte Chlamydomonas reinhardtii de modèle mésophiles 7 kDa. Nous avons combiné la transformation chloroplastique, mutagenèse dirigée, et la création de chimère fusion construit afin d'évaluer la contribution des domaines spécifiques et (ou) des résidus d'acides aminés à la structure, la stabilité et l'accumulation de cytochrome f, ainsi que sa fonction de transport d'électrons photosynthétique intersystème. Nous démontrons que les différences dans la séquence d'acides aminés du domaine petit et des acides aminés chargés dans le grand domaine du cytochrome f altérer les qualités physiques de cette protéine mais n'affectent pas la thermostabilité de l'hème de type c, la demi-vie apparente du cytochrome f en présence le chloramphénicol d'inhibiteur de synthèse de protéine chloroplastique, soit la capacité de transport d'électrons entre les systèmes photosynthétique, mesuré comme e-/ P700. Cependant, impulsion-étiquetage [14C] acétate, combiné avec l'immunobuvardage, a indiqué que l'autorégulation négative de l'accumulation de cytochrome f observée chez mésophile C. reinhardtii transformée avec des constructions chimériques from the psychrophile était probablement le résultat de l'association défectueux des formes chimériques du cytochrome f avec les autres sous-unités de type sauvage c. reinhardtii le complexe originaire de cytochrome b6/f. Ces résultats sont discutés en ce qui concerne la composition unique des acides gras des membranes thylakoïdes des c. raudensis UWO 241 adaptée aux environnements froids.
Homolog Arabidopsis De La Levure TREX-2 Complexe Exportation ARNm: Composants Et Ancrage Nucléoporine
Complexes des pores nucléaires (NPCs) sont vitales pour nucléo-cytoplasmique de communication chez les eucaryotes. La levure NPC-associé TREX-2 complexe, aussi connu comme le complexe THP1-Sac3-Cdc31-SUS1, est ancré sur le PNJ via le nucléoporine Nup1, et est essentielle pour l'exportation d'ARNm. Nous rapportons ici l'identification et la caractérisation de l'Arabidopsis thaliana putatif TREX-2 complexe et son ancrage nucléoporine. Soutien preuves matérielles et fonctionnelles de l'identification de l'Arabidopsis orthologues de la levure et THP1 Nup1. Sur les trois homologues d'Arabidopsis de levure Sac3, deux sont putatif TREX-2 composants, mais, étonnamment, aucune n'est requise pour l'exportation d'ARNm comme ils sont dans la levure. Association physique des deux Cdc31 homologues, mais pas l'homologue SUS1, avec le complexe TREX-2 a été observée. En plus de l'identification de ces TREX-2 composants, des interactions directes de l'homologue d'Arabidopsis DSS1, qui est une composante établie protéasome dans la levure et d'animaux, à la fois avec le complexe TREX-2 et le protéasome ont été observés. Cela suggère la possibilité d'un lien entre les deux complexes. Ainsi, ce travail a identifié l'Arabidopsis putatif TREX-2 complexe et fournit une base pour de futures études de l'exportation nucléaire dans Arabidopsis.
Transferrine De Sérum Humain Recombinant Végétale Montre Des Fonctions Multiples
Transferrine sérique humaine (hTf) est la principale protéine de fixation du fer dans le plasma humain, ayant un rôle essentiel dans le transport du fer. En outre, FASS a de nombreux autres usages, y compris les fonctions antimicrobiennes et facteur de croissance des effets sur la prolifération des cellules de mammifères et de la différenciation. La nature multitâche de FASS rend très précieux pour des applications thérapeutiques et commerciales différentes. Cependant, le succès de FASS dans ces applications est critique dépend de la disponibilité de FASS de haute qualité en grande quantité. Dans cette étude, nous avons développé des plantes comme une nouvelle plateforme pour la production de FASS recombinant (r). Nous montrons ici que les plantes transgéniques sont un système efficace pour la production de rhTf, avec une accumulation maximale de 0,25 % protéines solubles totales (TSP) (ou jusqu'à 33,5 microg/g de poids de feuilles fraîches). En outre, rhTf d'origine végétale conserve de nombreux de l'activité biologique et synonyme de FASS native. En particulier, rhTf réversible lie fer in vitro, présente une activité bactériostatique, prend en charge la prolifération des cellules dans un milieu sans sérum et peut être internalisé dans in vitro des cellules mammaliennes. Le succès de cette étude valide l'application future de la plante rhTf dans des domaines variés. Particulièrement intéressant est l'utilisation de plantes rhTf comme nouveau transporteur pour livraison spécifique des cellules ou par voie orale de médicaments de protéines/peptides pour le traitement des maladies humaines telles que le diabète.Pour démontrer cette hypothèse, nous avons en outre exprimé une protéine de fusion de FASS contenant le glucagon-like peptide 1 (GLP-1) ou ses dérivés chez les plantes. Ici, nous montrons que les protéines végétales hTf-GLP-1 conservent la possibilité d'être internalisés par lors de l'ajout au milieu de culture in vitro des cellules mammaliennes.
La Complémentation Du Mutant Pha2 Levure Suggère Des Différences Fonctionnelles Pour Arogénate Déshydratases D'Arabidopsis Thaliana
Les dernières étapes de la biosynthèse de la phénylalanine (Phe) dans les bactéries, les champignons et les plantes peuvent se produire via phénylpyruvate ou arogénate intermédiaires. Ces itinéraires sont déterminés par la présence de préphénate déshydratase (PDT, EC4.2.1.51), qui forme le phénylpyruvate de préphénate, ou arogénate déshydratase (ADT, EC4.2.1.91), qui forme la phénylalanine directement à partir d'arogénate. Nous avons comparé les séquences de select levure espèces à celles de l'Arabidopsis thaliana. L'in silico analyse a montré que planter ADTs et PDTs de levure partagent de nombreux points communs, ce qui leur permet d'agir comme déshydratase/décarboxylases. Cependant, les séquences de plantes et de levure groupe clairement conférant indépendamment des spécificités de substrat distinctes. La complémentation du mutant pha2 Saccharomyces cerevisiae, qui n'a pas d'activité de la PDT et ne peut pas se développer en l'absence de Phe exogène, a été utilisée pour tester l'activité de PDT d'a. thaliana ADTs in vivo. Caractérisation biochimique précédente a montré que tous les six AtADTs avaient une activité catalytique élevée avec arogénate comme substrat, tandis que AtADT1, AtADT2 et AtADT6 activité avec préphénate avaient aussi limitée. Conformément à ces résultats, le test de complémentation a montré Qu'atadt2 facilement récupéré le phénotype pha2 après 6 jours de croissance à 30 ° C, tandis que AtADT1 nécessaire −13 jours d'afficher une croissance visible. En revanche, AtADT6 (activité plus faible de PDT) et AtADT3-5 (aucune activité PDT) n'ont pas pu récupérer le phénotype. Ces résultats suggèrent que seulement AtADT1 et AtADT2, mais pas les quatre autres ADTs d'Arabidopsis, activité PDT fonctionnelle in vivo, montrant qu'il existe deux groupes distincts fonctionnelles. Nous émettons l'hypothèse que plante Qu'adts ont évolué pour utiliser la route arogénate pour Phe synthèse tout en gardant une activité résiduelle de la PDT.
