細胞・分子生物学の基礎的手法

多くの生医学実験において、正確で再現性があり正しい統計データを得るために、細胞数の確認が求められます。故にどの分野の生物学者にとっても、細胞数の計測は特に必要不可欠なテクニックとなります。細胞数計測の最も一般的なものは血球計算盤を使用した方法です。（血球計算盤;...

細胞株は短時間で培養でき、実験解析に必要な細胞型を増殖可能であるため、生医学実験に頻繁に利用されます。初代細胞と同様の条件下で培養されますが、いくつかの重要な基本的な相違点があります。: (1) 各細胞株には特殊なサプリメントが必要となります。(2)...

ポリメラーゼ連鎖反応、又はPCRは、温度変化; 一定の時間間隔で温度を変化させる、を利用しDNAを増幅する手法です。PCR法では、耐熱性DNAポリメラーゼを使用し、DNAの構成単位であるデオキシヌクレオチド三リン酸又はdNTPsを結合させ大量のDNAコピーを作り出すことができます。PCRには３つのステップ:...

DNAのゲル電気泳動は、DNA分子の検出と分離を行うための手法です。アガロースでできたゲルマトリックスに電場をかけることで、荷電した粒子が分子量に応じてゲル内を移動していきます。DNAを構成するリン酸基は負に荷電しているため、DNA分子は陽極方向へ移動します。このビデオでは、アガロースゲルを利用してDNA断片を分離するメカニズムやアガロースゲルの作製、DNAサンプルのロード、DNAの泳動、DNA断片の可視化、実験終了後のゲルとランニングバッファーの廃棄方法など各工程を紹介しています。...

ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、すなわちSDS-PAGEはタンパク質の大きさすなわち分子量に基づきタンパク質を分離する手法であり広く利用されています。SDSは陰イオン性界面活性剤であり、タンパク質の電荷を一定にし、形を直鎖状にするために用いられます。SDSとタンパク質の複合体をポリアクリルアミドゲルにロードし電気泳動すると、その複合体の分離が始まります。与えられた電場によりSDSとタンパク質の複合体は陽極へ移動していきます。そのとき分子量の大きいタンパク質は小さいものよりもゆっくりと動きます。目的のタンパク質の分子量を確認するために分子量マーカーをサンプルと同時に泳動します。このビデオでは、まずSDS-PAGEの背景を紹介し、その後その手法を段階的に説明しています。その中でポリアクリルアミドの濃度やゲルにかける適切な電圧など様々な実験パラメーターについても説明しています。さらにクマシー染色や銀染色のような染色法に加え、二次元電気泳動法も紹介しています。...

形質転換(transformation)とは細胞が周囲の外来DNAを取り込むプロセスのことです。ある特定のバクテリアにとって形質転換は自然現象です。分子生物学では、バクテリアの細胞壁に穴を開けることにより人為的に形質転換を誘発します。周囲からDNAを取り込み可能なバクテリア細胞はコンピテントセルと呼ばれます。実験では、バクテリア細胞が外来DNAを取り込める状態（コンピテント状態）にした後に、ヒートショック法と呼ばれる手法を利用してDNAを細胞内に導入します。ヒートショック法を用いた形質転換では、まずプラスミドDNAとバクテリアの細胞壁間の静電反発力を中和するために塩化カルシウムを使ってカルシウムが豊富な環境を作り出します。その後急激に温度を上げることにより、バクテリアの細胞膜に穴が形成され、そこからプラスミドが細胞内に取り込まれます。このビデオでは、ケミカルコンピテントセルの調製方法、ヒートショックを用いた形質転換法、形質転換したバクテリアの播種の仕方、形質転換効率の算出法など各工程を紹介しています。...

形質転換（transformation）とは、外来DNAが細胞内へ取り込まれることをいいます。自然界においてある特定のバクテリアは形質転換を行うことができます。しかし分子生物学での形質転換は、バクテリアの細胞壁に穴を空けることにより人為的に誘発させます。周囲のDNAを取り込み可能なバクテリアをコンピテントセルと呼びます。エレクトロコンピテントセルは特にエレクトロポレーション用に作製された細胞で、電場を利用して細胞壁に穴を形成しDNAを導入する方法で形質転換を行う際に利用します。このビデオでは、エレクトロポレーション用の装置であるエレクトロポレーター、エレクトロポレーション用キュベットについて、またエレクトロコンピテントセルの調製法や目的細胞への電気刺激の方法など各工程を紹介しています。時定数を利用した形質転換成功の確認方法、さらにエレクトロポレーション実施時の塩除去の重要性などにも触れています。...

酵素免疫測定法(ELISA法)は、通常、目的のタンパク質の存在や量を検出するために利用されます。標的タンパク質の検出には抗体を用いるため、ELISA法は免疫学的測定法の一つになります。インキュベーションと洗浄の工程を通して、抗体（多くは酵素で標識されている）によりマイクロプレートリーダーのウェルにコートされたタンパク質が検出されます。その後、酵素抗体反応により発色させ、サンプル中の目的タンパク質の存在が確認できるようになります。このビデオでは、ELISA法の基本理論、一次抗体、二次抗体について説明し、さらにブロッキング工程の重要性などにも触れています。各工程を実際に確認しながらELISA法の理論を学ぶことができます。また、ELISA法の一種である、サンドイッチ法や競合法について、さらに市販の妊娠検査薬などELISA法の応用例についても紹介しています。...

プラスミドの精製はゲノムDNA、タンパク質、リボソーム、バクテリアの細胞壁を取り除き、プラスミドDNAを単離する手法です。プラスミドは小さい環状の二本鎖DNAであり、特異的DNA分子の担体として利用されます。形質転換により宿主生物に導入されたプラスミドは複製されて多数のDNA断片コピーを得ることができ、研究に広く利用されています。このビデオでは、プラスミド精製の一般的な手技を紹介しています。プラスミドを精製するための３つの基本ステップ:...

ゲルを用いた精製は電気泳動による分離後にDNA断片を回収するための手法です。アガロースゲルからのDNA回収には3つのステップ:...

ウェスタンブロッティングは、電気泳動により分離サンプル中の特定のタンパク質の存在を同定するために使用される。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはSDS-PAGEと呼ばれる手法による分離の後、西洋転送するそれぞれの場所でトラップタンパク質を、膜の一部上にポリアクリルアミドゲルからのタンパク質を移動させるために使用される。次に、膜をimmunboblottingと呼ばれるプロセス中の抗体でプローブされています。イムノブロットは、単一のタンパク質を同定するために必要な高い特異性を提供する、特定の認識部位を通じて抗体タンパク質と抗体 - 抗体結合を使用しています。抗体の検出は、酵素の使用を含むレポーター系を用いて行われる。酵素、抗体の端部に取り付けられ、色または光の変化を生成するために基材と反応することができる。これらの信号は、撮像されデンシトメトリーと呼ばれるプロセスを使用して定量することができる。...

トランスフェクションとは、DNAや二本鎖RNAなどの遺伝物質を哺乳動物細胞に導入する手法です。DNA導入によりタンパク質の発現や合成をその細胞自身に誘導させることができます。それに対しRNA導入は翻訳を阻害するため、特異的なタンパク質の合成を抑制することができます。導入されたRNAの働き場所が細胞質である一方、DNAは核まで輸送させなければトランスフェクションが成功しません。DNAは短時間一過性に発現させることも、ゲノムDNAに組み込ませ細胞分裂の度に細胞から細胞へ受け渡すこともできます。このビデオでは、化学的物質を用いたトランスフェクション法や荷電脂質、ポリマー、リン酸カルシウムなどの一般的に使用される試薬を紹介しています。トランスフェクション用の細胞の準備方法からトランスフェクション効果の分析方法までの各ステップを説明しています。さらにビデオジャーナルの応用の項では、エレクトロポレーション法、哺乳動物細胞に核酸を導入する代替方法として、遺伝子銃を用いたトランスフェクション法を紹介しています。また、より高度な手法である干渉RNAとDNAの共導入法（コトランスフェクション法）も紹介して...

分子生物学において、ライゲーションとは、2つのDNA断片をリン酸ジエステル結合により連結することと定義されています。リガーゼとはライゲーション反応を触媒する酵素であり、細胞内でDNA複製中に生成される一本鎖および二本鎖切断の修復を行います。実験では、DNAリガーセを用いた分子クローニングが行われており、挿入するDNA断片とベクターを連結し、宿主生物内で標的断片を複製するキャリヤDNA分子を作製します。このビデオでは、DNAライゲーションについて紹介しています。まずはライゲーションの基本原理とライゲーション反応の一般的なセットアップ方法を段階的に説明し、次にライゲーションの重要な鍵となる事項:...

制限酵素、又はエンドヌクレアーゼは特定配列を認識しDNAを切断します。本来この酵素はバクテリオファージ（バクテリアに感染するウイルス）に対する防御機構としてバクテリアが作り出すものです。バクテリアの制限酵素は侵入したバクテリオファージのDNAを切断します。しかしバクテリア自身のゲノムDNAはメチル基が付加されているため制限酵素により認識されません。このビデオでは、まず制限酵素の基本原理:...

分子クローニングとは、組み換えDNAをベクター（DNAの担体）に挿入し宿主生物内でそのDNA断片を複製させる一連のテクニックです。DNA断片（目的遺伝子）は、原核生物又は真核生物サンプルから単離できます。目的断片、別名インサート、を単離後、ベクターとインサートを同じ制限酵素で切断し精製します。その精製したベクターとインサートをライゲーションという手法を利用し繋ぎ合わせます。ライゲーション反応を触媒する酵素はリガーゼです。このビデオでは、主要な実験方法の説明と共に全般的な分子クローニング工程をご覧いただけます。分子クローニング実験の鍵となる、実験戦略の重要性や形質転換したバクテリアコロニーのトラッキング方法、さらに精製したプラスミドにインサートが含まれているか制限酵素処理により確認する方法やシークエンシングによる確認方法も紹介しています。...