Summary
Эта процедура описывает, как установить первичный гемопоэтических клеточных культур из мышиного костного мозга и сопровождается трансфекции с использованием генной Pulser MXCell электропорации системы.
Abstract
Становится все более очевидным, что электропорации является наиболее эффективным способом введения плазмидной ДНК или миРНК в первичные клетки. Гена Pulser MXcell система электропорации и Джин Pulser электропорации буфера были специально разработаны для трансфекции нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих и трудных для трансфекции клеток, таких как первичный и стволовых cells.This видеоролике показано, как создать первичную гемопоэтических клеточных культур из мышиных костного мозга , а затем подготовить их к электропорации в системе MXcell. Начнем с выделения бедра и голени. Костный мозг с обеих бедра и голени затем собирают и культуры устанавливаются. Культивируемых клеток костного мозга, затем трансфекции и анализировали.
Protocol
Сбор костного мозга от бедра и голени
- Первый этап процедуры для сбора костного мозга от бедра и голени 6 - на 12-недельных мышей (мы используем BALB / с мышами, но вы можете сделать эту процедуру с любым мыши деформации). Во-первых, усыпить мыши СО 2 ингаляции (не будет показан). Урожай бедра и голени от задних ног каждого из них. Затем, с лезвием, разрезать каждый конец бедренной кости для удаления тазобедренных и коленных суставах и разоблачить мозга.
- Таким же образом, сократить каждом конце голени, чтобы удалить коленного и голеностопного прилегающих районов и разоблачить мозга.
- Возьмите 3 мл шприц с 26-иглы и залейте его RPMI с добавлением 10% FBS, пенициллин, стрептомицин, и бета-меркаптоэтанола (BME = 100 мкм). С помощью пинцета держать кости более чашки Петри содержащей RPMI СМИ. Вставьте иглу шприца в один конец кости и нажмите поршень, чтобы избавиться от костного мозга. Иглу шприца можно перемещать вверх и вниз внутри кости, чтобы избавиться от остаточных мозга.
- Повторите процедуру для всех костей, а затем продолжить создание культур.
Создание культур
- Установить кости культур мозга, пипетки вспыхнул костного мозга вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить ткани в клеточной суспензии.
- Место 70 микрон фильтр на вершине 50 мл коническую трубку, и добавить клеточной суспензии в фильтр.
- Полоскание чашки Петри одно время с RPMI, а затем добавить промыть в фильтре 70 мкм.
- Использование резиновых конце 1 мл шприца, перемалывать кости частей мозга, оставшиеся на начало 70-микронный фильтр.
- Промойте фильтр один раз с RPMI.
- После промывки фильтров, центрифуг клеточной суспензии при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут.
- Промыть осадок клеток путем суспендирования в PBS.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра. Как правило, мы получаем ~ 90 миллионов клеток из костей одним кликом (две бедренные кости и две голени). После подсчета клеток, центрифуги их снова при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут.
- Ресуспендируют клетки в небольшом количестве RPMI и аликвоту их в культуре ткани колбы, содержащие достаточно RPMI так, чтобы конечная концентрация составляет 1 млн. клеток в мл.
- Добавить цитокинов способствовать развитию вашего типа клеток, представляющих интерес. В этом случае, цитокина интерлейкина-3 (IL-3 = 10 нг / мл) в целях содействия развитию базофилов и тучных клеток. Для приобретения базофилов, инкубировать в течение 10 дней. Для тучных клеток, инкубировать в течение 5 недель. При создании тучных клеток, средств массовой информации и IL-3 должен быть изменен раз в неделю.
- Вот посмотрите, как тучные клетки должны появиться сразу после металлизации. Это изображение показывает дифференциацию тучных клеток мозга в базофилов и тучных клеток через 10 дней после того интерлейкина-3.
- Как только желательный тип клеток получается, переходите к шагу электропорации.
Клетки Electroporating
- Для начала электропорации шаг, определить количество клеток в культуре колбу.
- Клетки, как правило, электропорации при плотности 10 миллионов в мл, поэтому передача необходимого количества ячейки конических труб и труб центрифуге при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут.
- После центрифугирования, аспирация СМИ, мыть клетки с 1X PBS, и вновь центрифуге при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут.
- Аспирируйте PBS и добавьте Bio-Rad Гена Pulser электропорации буфера, чтобы сделать клеточную суспензию из 10 миллионов клеток на мл.
- После ресуспендирования клеток, добавьте нужные ДНК плазмиды в конечной концентрации от 10 до 20 мкг на мл.
- Алиготе 150 мкл суспензии клеток в лунки свой выбор на 96-луночного электропорации пластины.
- Положите электропорации пластины в камере пластины MXcell и закрыть крышкой.
- До трансфекции тучных клеток, электропорации протокол должен быть запрограммирован в MXcell за исключением использования предустановок или хранится протокол. Благодаря оптимизации экспериментов мы обнаружили, что высокая эффективность трансфекции тучных клеток происходит с помощью квадратных протоколов пульсовой волны. Мы будем меняться электропорации условий на пластине для доставки 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms и 350V/10ms импульсов прямоугольной волны в конденсатор на 2000мкФ и 1000 Ом. Как только протокол был установлен и загружен на устройства, нажмите «Пульс», чтобы electroporate клеток.
- После электропорации завершения передачи клеткам планшета для культуры ткани. Как правило, мы передачи по 150 мкл электропорации образец хорошо в 48-луночного культуре ткани пластину, содержащую 300 мкл RPMI (с добавлением 10% FCS, пенициллин, стрептомицин, и бета-меркаптоэтанол) с 10 нанограмм на мл интерлейкина-3. Клетки инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° С, затем анализировали через 24 часа для выражения мнения и подавление.
ТранРезультаты sfection
Флуоресцентное изображение микроскопии клеток после успешного электропорации с использованием 20 мкг на мл GFP плазмиды показан на видео. Использование электропорации MXcell системы трансфекции эффективности около 30% могут быть получены. Система позволяет варьировать условия для максимальной эффективности трансфекции, сохраняя жизнеспособность клеток.
Discussion
Поскольку все больше появляется геномной информации и новые инструменты, такие как миРНК разработаны, применение физиологически соответствующие клетки становится все более важным дальнейшее наше понимание болезни путей, белок-белковых взаимодействий и передачи сигнала. Первичные элементы получаются непосредственно из ткани или жидкости и культивируемых в лабораторных условиях. Эти клетки можно манипулировать различными способами, в том числе путем введения экзогенного генетического материала. Становится все более очевидным, что наиболее эффективным способом введения плазмидной ДНК или миРНК в первичные клетки электропорации.
Электропорация выставляет клетках в электрические импульсы для того, чтобы временно увеличивают проницаемость клеточных мембран, тем самым позволяя экзогенных нуклеиновых кислот, чтобы войти в камеру. Этот метод трансфекции может быть оптимизирована, чтобы учесть различия между различными типами клеток / линии и, таким образом, могут быть использованы для трансфекции тучных клеток, а также любые другие костномозгового происхождения клетки. Кроме того, в отличие от вирусного-опосредованной трансфекции, электропорации не накладывает ограничений на размер трансфекции ДНК, не требуют серьезной подготовки. В отличие от липидных-опосредованной трансфекции, электропорации может быть менее токсичны и не приводит к эндосом захвата трансфекции нуклеиновых кислот.
Bio-Rad разработана система MXcell электропорации специально для этих клеток. MXcell позволяет варьировать условия для максимальной эффективности трансфекции и жизнеспособности клеток. В целях оптимизации эффективности трансфекции и свести к минимуму гибель клеток, множество параметров, включая электропорации напряжения, емкости, сопротивления и длительности импульса можно регулировать и оценивать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser MXcell Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | |
| Gene Pulser Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2677 |
