Summary
Denna procedur beskriver hur man kan upprätta primära hematopoetisk cellkulturer från murina benmärg och följs av transfektion med Gene Pulser MXCell elektroporation system.
Abstract
Det blir allt tydligare att elektroporation är det mest effektiva sättet att införa plasmid DNA eller siRNA i primära celler. Den Gene Pulser MXcell elektroporation systemet och Gene Pulser elektroporation buffert har utvecklats speciellt för att transfektera nukleinsyror in i däggdjursceller och svåra att transfektera celler, t.ex. primär och stamceller cells.This video visar hur du etablera primära hematopoetisk cellkulturer från murina benmärg , och sedan förbereda dem för elektroporation i MXcell systemet. Vi börjar med att isolera lårben och skenben. Benmärg från både lårbenet och skenbenet är sedan skördas och kulturer är etablerade. Odlade benmärgsceller sedan transfekterade och analyseras.
Protocol
Skörd benmärg från lårben och Tibiae
- Det första steget i förfarandet är att skörda benmärg från lårben och tibiae av en 6 - till 12-veckors gamla mus (vi använder BALB / c möss men du kan göra den här proceduren med alla musstam). Till att börja avliva musen av CO 2 inandning (kommer inte att visas). Harvest lårbenet och tibiae från bakbenen av varje. Då, med ett rakblad, skär varje ände av lårben att ta bort höft-och knäledsartros och avslöja märgen.
- På ett liknande sätt, skär varje ände av tibiae att ta bort knä och fotled angränsande regioner och för att exponera märgen.
- Ta en 3 ml spruta med en 26-gauge kanylen och fyll den med RPMI kompletterad med 10% FBS, penicillin, streptomycin, och beta-merkaptoetanol (BME = 100 um). Använda pincett, håll benet över en petriskål med RPMI medier. För in injektionsnålen i ena änden av benet och tryck in kolven att spola ut benmärgen. Sprutnålen kan flyttas upp och ner inne i benet att spola ut kvarvarande märg.
- Upprepa proceduren för alla ben, och sedan gå vidare med upprättandet av kulturer.
Etablera kulturer
- Att etablera benmärgen kulturer, pipett de spolas benmärgen upp och ner flera gånger för att bryta upp vävnaden i en cell suspension.
- Placera ett 70 mikron filter på toppen av en 50 ml koniska rör och tillsätt cellsuspension till filtret.
- Skölj petriskål en tid med RPMI, tillsätt sedan skölj till 70 micron filter.
- Med hjälp av gummi slutet av en 1 ml spruta kolv, slipa benmärgen bitar kvar på toppen av 70 micron filter.
- Tvätta filtret en gång med RPMI.
- Efter tvättning av filtret, centrifugera cellsuspension vid 1200 rpm i 5 minuter.
- Tvätta cellpelleten av resuspending i PBS.
- Räkna celler med en hemocytometer. Vi får vanligtvis ~ 90 miljoner celler från en mus ben (två lårben plus två tibiae). Efter att ha räknat de celler, centrifugera dem igen vid 1200 rpm i 5 minuter.
- Resuspendera cellerna i en liten mängd RPMI och delprov dem i vävnadsodling flaskor som innehåller tillräckligt RPMI så att den slutliga koncentrationen är 1 miljon celler per ml.
- Lägg cytokiner för att främja utvecklingen av celltypen av intresse. I detta fall är den cytokin interleukin-3 (IL-3 = 10 ng / ml) tillsätts för att främja utvecklingen av basofiler och mastceller. Att förvärva basofiler, inkubera i 10 dagar. För mastceller, inkubera i 5 veckor. När du skapar mastceller, media och IL-3 bör bytas en gång i veckan.
- Här är en titt på hur mastcellerna ska visas strax efter plätering. Denna bild visar differentiering av masten benmärg celler i basofiler och mastceller 10 dagar efter tillsats av interleukin-3.
- När önskad celltyp uppnås, fortsätt med elektroporation steg.
Electroporating Celler
- För att börja elektroporation steget, bestämma antalet celler i kulturen kolven.
- Celler normalt är electroporated vid en densitet av 10 miljoner per ml, så överför den önskade cellen nummer koniska rör och centrifugera rören vid 1200 rpm i 5 minuter.
- Efter centrifugering, aspirera media, tvätta cellerna med 1X PBS och centrifugera igen vid 1200 rpm i 5 minuter.
- Aspirera PBS och lägga till Bio-Rad Gene Pulser elektroporation buffert för att göra en cellsuspension på 10 miljoner celler per ml.
- Efter resuspending cellerna lägger du plasmid-DNA till en slutlig koncentration på 10 till 20 mikrogram per ml.
- Alikvotera 150 mikroliter av cellsuspensionen i brunnar av dina val på ett 96-bra elektroporation plattan.
- Sätt elektroporation plattan i MXcell plattan kammaren och stäng locket.
- Innan transfektion av mastceller, måste en elektroporation protokoll programmeras in i MXcell inte använda en förinställd eller lagras protokollet. Genom optimering experiment har vi upptäckt att den högsta transfektion effektivitet av mastceller sker med hjälp av fyrkantiga protokoll våg puls. Vi kommer att variera elektroporation förhållandena på tallriken för att leverera 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms och 350V/10ms fyrkantpuls våg på 2000uF och 1000 ohm. När protokollet har ställts in och lastas på enheten, tryck på "Puls" för att electroporate cellerna.
- Efter elektroporation är klar överföra celler till en vävnadskultur tallrik. Vi överför normalt varje 150 prov mikroliter elektroporering en bra i ett 48-och vävnadsodling skylt som innehåller 300 mikroliter RPMI (kompletterad med 10% FCS, penicillin, streptomycin, och beta-merkaptoetanol) med 10 nanogram per ml interleukin-3. Cellerna inkuberas över natten vid 37 ° C, därefter analyserades 24 timmar senare för uttryck och undertryckande.
Transfection Resultat
Den fluorescerande mikroskopi bild av cellerna efter framgångsrik elektroporation med 20 mikrogram per ml GFP plasmiden visas i videon. Använda MXcell elektroporation effektivitet systemet transfektion av ca 30% kan erhållas. Systemet gör att du kan variera villkor att maximera din transfektion effektivitet, samtidigt som cellernas livskraft.
Discussion
När fler genetisk information framkommer och nya verktyg som t.ex. siRNA utvecklas, har användningen av fysiologiskt relevanta celler blir allt viktigare att öka våra kunskaper om sjukdomen vägar, protein-protein växelverkan, och signaltransduktion. Primära celler erhålls direkt från vävnader eller vätskor och odlas in vitro. Dessa celler kan manipuleras på ett antal sätt, bland annat genom införandet av genetiskt material. Det blir allt tydligare att det mest effektiva sättet att införa plasmid DNA eller siRNA i primära celler elektroporation.
Elektroporation utsätter celler för elektriska pulser för att övergående öka permeabilitet cellmembranet, vilket möjliggör exogen nukleinsyror att komma in i cellen. Denna metod för transfektion kan optimeras för att rymma för skillnader mellan olika celltyper / linjer och därmed kan användas för att transfektera mastceller, liksom alla andra härledd från benmärg cell. Till skillnad från virus-medierad transfektion, medför elektroporation inte gränser för storleken på transfekterade DNA, och inte heller kräva omfattande förberedelser. I motsats till lipid-medierad transfektion kan elektroporation vara mindre giftiga och inte leder till endosomal fånga de transfekterade nukleinsyra.
Bio-Rad har utvecklat MXcell elektroporation systemet specifikt för dessa celler. den MXcell gör att du kan variera förutsättningar för att maximera din transfektion effektivitet och cellernas livskraft. För att optimera transfektion effektiviteten och minimera celldöd, en mångfald av elektroporation parametrar, bland annat spänning, kan kapacitans, resistans och pulslängd ställas och utvärderas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser MXcell Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | |
| Gene Pulser Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2677 |
