और व्यवहार्य माउस आईएल 17-स्रावित टी कोशिकाओं की जांच अलगाव

Summary

यह प्रक्रिया और माउस Th17 leukocytes है कि सक्रिय रूप से उत्तेजना पर आईएल -17 छिपाना के अलगाव का पता लगाने का वर्णन करता है.

Abstract

एमएसीएस cytokine स्राव परख प्रौद्योगिकी एकल कोशिका के स्तर और व्यवहार्य cytokine स्रावित कोशिकाओं के प्रति संवेदनशील अलगाव पर secreted साइटोकिन्स का पता लगाने की अनुमति देता है. आदेश में आईएल 17 स्रावित - कोशिकाओं, माउस splenocytes की एक एकल कक्ष निलंबन तैयार और उत्तेजित 37 ° सी PMA / ionomycin साथ cytokine स्राव उत्पन्न करने के लिए लेबल. स्राव कोशिकाओं को रोकने के लिए तो बर्फ पर रखा जाता है और आईएल 17 पकड़ो अभिकर्मक को उजागर कर रहे हैं एक द्वि - विशिष्ट एंटीबॉडी कि leukocytes की कोशिका की सतह पर और आईएल -17 CD45 को बांध के रूप में यह secreted है और कोशिका की सतह के पास पकड़ा. स्राव है तो फिर से 37 तक तापमान में वृद्धि से शुरू डिग्री सेल्सियस और आईएल -17 पकड़ो अभिकर्मक द्वारा फंस गया है. स्राव तो फिर से बंद कर दिया है बर्फ पर कोशिकाओं रखकर. फंस आईएल -17 का पता लगाने के लिए, कोशिकाओं एक दूसरे आईएल 17-विशिष्ट एंटीबॉडी बायोटिन संयुग्मित और एक एंटीबॉडी विरोधी बायोटिन पीई के साथ incubated हैं. कक्ष प्रवाह cytometry द्वारा अब सीधे कर सकते हैं विश्लेषण किया या अलगाव और विरोधी पीई संयुग्मित microbeads के साथ बाद लेबलिंग द्वारा संवर्धन के लिए तैयार है.

Protocol

अभिकर्मकों की तैयारी

1. BSA (0.5%), और 2 मिमी EDTA के साथ पीबीएस युक्त बफर बनाओ. क्योंकि हवा बुलबुले एमएसीएस जुदाई स्तंभों को ब्लॉक कर सकते हैं, बफर degassed और 2-8 ° उपयोग पर पहले सी संग्रहित किया जाना चाहिए.
2. हम RPMI +१६४० मध्यम युक्त 5% माउस सीरम का उपयोग करें. संस्कृति के माध्यम BSA या FCS नहीं होते हैं, इन यौगिकों के रूप में सेल उत्तेजना की विशिष्टता बदल जाएगा चाहिए.
3. माउस आईएल 17 स्राव परख - सेल संवर्धन और Miltenyi बायोटेक से जांच किट. आईएल 17 पकड़ो अभिकर्मक, आईएल 17 जांच एंटीबॉडी (बायोटिन), एंटी बायोटिन पीई, और विरोधी पीई microbeads: किट में निम्नलिखित घटक शामिल हैं.

Splenocytes उत्तेजक

1. इस प्रोटोकॉल unstimulated splenocytes और टी कोशिकाओं के लिए एक counterstain के रूप में एक नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण, की उपस्थिति में किया जाता है. इस प्रोटोकॉल से बाहर बाँझ तकनीक का उपयोग किया जाता है.
2. माउस splenocytes कि gentleMACS ™ Dissociator का उपयोग कर अलग थे की एक एकल कक्ष निलंबन तैयार. कक्षों की एकाग्रता सेल गिनती के माध्यम से पूर्व निर्धारित किया जाना चाहिए. गोली कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 200 × छ में कोशिकाओं.
3. Centrifugation के बाद, गोली बंद सतह पर तैरनेवाला एक विंदुक का उपयोग aspirate. ट्यूब छानना गोली के नुकसान से बचने मत करो.
4. अब, मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं resuspend और फिर एक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ने. एमएल प्रति दस लाख कोशिकाओं और पांच लाख प्रति वर्ग सेमी कक्षों की एकाग्रता के लिए पर्याप्त माध्यम जोड़ें.
5. हमारे resuspended कोशिकाओं में एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रोत्साहित करने के लिए, हम नमूना ionomycin (1 μg / एमएल) और PMA (10 एनजी / एमएल) जोड़ने और धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा समाधान मिश्रण. फिर कुओं तदनुसार लेबल रहे हैं.
6. अब, हम 37 पर 3 घंटे के लिए हमारी कोशिकाओं सेते जाएगा ° सी उत्तेजना अवधि शुरू मिश्रण के साथ. उत्तेजना की शुरुआत से आईएल -17 विश्लेषण 3 घंटे के लिए आगे बढ़ें, तो तदनुसार योजना है.
7. स्राव को रोक करने के लिए, कोशिकाओं को बर्फ पर रखा जाता है और हम धीरे ठंड बफर के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा प्रेरित कोशिकाओं को इकट्ठा. कक्ष फिर अच्छी तरह से एक ट्यूब के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं और दूसरी बार धोया है.
8. सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को एकत्र कर रहे हैं, यह एक खुर्दबीन के नीचे अपने पकवान की जांच के लिए एक अच्छा विचार है. यदि कोशिकाओं को अभी भी संलग्न रहते हैं, तो आप ठंड बफर के साथ पकवान rinsing द्वारा शेष कोशिकाओं को इकट्ठा कर सकते हैं. अपने सेल निलंबन में कोई कक्ष clumps पूर्व जुदाई फिल्टर का उपयोग कर हटाया जा सकता है है.

पकड़ो अभिकर्मक के साथ कोशिकाओं लेबल

1. यह ध्यान दें करने के लिए सर्वोपरि है, कि इस परख बेहतर काम करता है अगर आईएल 17-स्रावित कोशिकाओं के कम से कम 2% मौजूद हैं.
2. यदि आईएल 17-स्रावित कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए 2% से अधिक मात्रा तदनुसार समायोजित करने के लिए उम्मीद है.
   
3. इस प्रक्रिया के एक ख़तरा संभावित पकड़ो अभिकर्मक के पार संदूषण, जो लेबलिंग के दौरान होती है जब द्वि - विशिष्ट एंटीबॉडी टी गैर स्रावित सेल और एक पड़ोसी लिम्फोसाइट से secreted आईएल -17 जाल को बांधता है, जिससे झूठी सकारात्मक पैदा कर सकते है.
4. आदेश में इस समस्या को नाकाम करने के लिए, यह नीचे से पहले लेबलिंग और ठंड के बफर के साथ काम करने के लिए शांत कोशिकाओं को आईएल -17 के प्रसार को धीमा करने के लिए महत्वपूर्ण है और इस पार संक्रमण से बचने. कोशिकाओं को ठंड रखने के लिए इसके अलावा, वे एक परिभाषित एकाग्रता में रखा जाना चाहिए.
5. लेबलिंग प्रक्रिया शुरू करने के लिए, हम एक 15 मिलीलीटर closable ट्यूब में दस लाख कक्षों का उपयोग करें. यदि उच्च सेल नंबर के लिए इस्तेमाल किया जा है, बस सभी संस्करणों के अनुसार पैमाने. एक बार इष्टतम सेल एकाग्रता प्राप्त किया गया है, ठंड बफर के 10 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं धोने.
6. नीचे एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में 10 मिनट (2-8 डिग्री सेल्सियस) के लिए 300 से कोशिकाओं × छ स्पिन.
7. Centrifugation के बाद, पूरी तरह से एक विंदुक का उपयोग सतह पर तैरनेवाला aspirate. सतह पर तैरनेवाला छानना के रूप में इस सेल घटाने और imprecise संस्करणों के लिए नेतृत्व करेंगे नहीं है. धोने कदम है जो ठंड बफर, centrifugation और आकांक्षा के 10ml जोड़ने के होते हैं दोहराएँ.
8. अब जब कि हम वांछित शुद्धता की एक गोली है, ठंड संस्कृति के माध्यम के 80 μL में कोशिकाओं resuspend. उन्हें लेबल करने के लिए, हम अब माउस आईएल 17 पकड़ो अभिकर्मक के 20 μL जोड़ देगा.
9. बर्फ पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
10. बर्फ पर 5 मिनट ऊष्मायन अवधि के बाद, ट्यूब हटा दें और 37 डिग्री सेल्सियस गर्म माध्यम के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं पतला. फिर MACSmix ट्यूब अंग को घुमानेवाली पेशी पर ट्यूब सुरक्षित और 37 में ट्यूब सेते ° सतत गति के अंतर्गत 45 मिनट के लिए सी. 37 तक तापमान बढ़ाने डिग्री सेल्सियस cytokine स्राव फिर से शुरू होगा.

आईएल -17 जांच (बायोटिन) एंटीबॉडी और विरोधी बायोटिन पीई के साथ लेबल कक्ष

1. 45 मिनट 37 ° C पर स्राव अवधि के बाद, ट्यूब तुरंत जगह बर्फ पर. इस cytokine स्राव बंद हो जाएगा. यहाँ से उस पर बर्फ पर कोशिकाओं को रखने के लिए महत्वपूर्ण है.ठंड के बफर के साथ कार्य करना पकड़ो अभिकर्मक के पार संदूषण से बचना होगा.
2. 300xg पर ठंड बफर और अपकेंद्रित्र 2-8 ° 10 मिनट के लिए सी के साथ ट्यूब भरें. पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला Aspirate. दोहराएँ धोने एक बार और कदम है.
3. सेल गोली ठंड बफर के 80 μL में resuspended है और ट्यूब बर्फ पर रखा है.
4. एंटीबॉडी के unspecific बंधन से बचने के लिए है, हम 10μl FCR अवरुद्ध और 5 मिनट के लिए बर्फ पर अभिकर्मक सेते के अलावा सलाह देते हैं. तो फिर हम माउस आईएल -17 जांच एंटीबॉडी (बायोटिन) के 20 μL है कि बायोटिन और बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते संयुग्मित है जोड़ें.
5. एक बार फिर, कोशिकाओं के रूप में हम पहले 300xg पर 2-8 पर ठंड बफर और अपकेंद्रित्र के 10 एमएल ° 10 मिनट जोड़ने के लिए सी के द्वारा किया है धो लो.
6. अब aspirate सतह पर तैरनेवाला और ठंड बफर के 80 μl में सेल गोली resuspend.
7. हमारे माध्यमिक एंटीबॉडी, विरोधी बायोटिन पीई के 20 μL जोड़ें.
8. कोशिकाओं और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान मिक्स, और फिर बर्फ पर 10 मिनट के लिए ट्यूब सेते हैं.
9. है एक बार यह दूसरा ऊष्मायन पूरा हो गया है, 10 एमएल ठंड बफर और अपकेंद्रित्र के साथ कोशिकाओं को धो लो.
10. गोली अब ठंड बफर के 500 μL में resuspended जा सकता है.
11. यदि कोशिकाओं को आगे बहाव के विश्लेषण के लिए अलग किया जाना है, वे चुंबकीय विरोधी पीई microbeads के साथ लेबल किया जा सकता है और मैन्युअल रूप से या स्वचालित अलग एमएसीएस स्तंभ और एमएसीएस विभाजक का उपयोग.
12. हम अब splenocytes की लेबलिंग पूरी कर ली है और विश्लेषण के लिए तैयार हैं.

FACS विश्लेषण

1. हमारे विश्लेषण के लिए, हम प्रवाह cytometry द्वारा प्रेरित और unstimulated splenocytes तुलना करेंगे.
2. प्रवाह cytometric विश्लेषण से पहले, कोशिकाओं propidium आयोडाइड के साथ 0.5 μg / एमएल मृत कोशिकाओं को बाहर फाटक के दाग हैं. MACSQuant ™ विश्लेषक प्रत्येक नमूना के लिए 200,000 कोशिकाओं के साथ भरी हुई थी और अब हम नमूनों में रिश्तेदार एंटीबॉडी जेट के स्कैटर भूखंडों को देखने जा रहे हैं. आईएल 17 सकारात्मक कोशिकाओं की तरह - दुर्लभ कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए दो महत्वपूर्ण विचार प्रवाह cytometry द्वारा कर रहे हैं:
   • लिम्फोसाइटों पर आगे तितर बितर बनाम ओर तितर बितर साजिश में एक गेट की स्थापना
   • और मृत कोशिकाओं (propidium आयोडाइड के साथ दाग) और बी कोशिकाओं (जो unspecific पृष्ठभूमि धुंधला कारण हो सकता है) बाहर gating आगे का पता लगाने की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए
3. हम सीडी 4 - APC एंटीबॉडी का इस्तेमाल करने के लिए टी कोशिकाओं और CD45R/B220-PerCP बी कोशिकाओं का पता लगाने के एंटीबॉडी का पता लगाने. हम आगे और पक्ष नमूनों की स्कैटर गुण देखें और लिम्फोसाइट जनसंख्या पर एक गेट लागू.
4. एक दूसरे गेट दाग मृत कोशिकाओं और दाग बी कोशिकाओं (y अक्ष) को देखने के लिए लागू किया गया था. इन कोशिकाओं टी सेल विश्लेषण से बाहर रखा गया है.
5. इस उदाहरण में है, जो अनिवार्य रूप से हमारे नकारात्मक नियंत्रण है, हम है कि वहाँ unstimulated नमूनों में बहुत कुछ सकारात्मक आईएल 17 स्रावित CD4 टी कोशिकाओं रहे हैं देख सकते हैं - लगभग 0.003% (चित्रा 4). उत्तेजित टी सेल की आबादी को देखते हुए, हम सीडी 4 की एक पर्याप्त संख्या सकारात्मक टी कोशिकाओं को देख सकते हैं कि आईएल -17 छिपाना - जुदाई से पहले 0.367% (चित्रा 5A) के बारे में और एमएसीएस प्रौद्योगिकी (चित्रा 5B) के साथ चुंबकीय जुदाई के बाद 60.76%.

Discussion

Th17 कोशिकाओं अनुकूली प्रतिरक्षा और भड़काऊ प्रतिक्रिया में एक अभिन्न भूमिका निभाते हैं और autoimmune सूजन ड्राइविंग में एक महत्वपूर्ण घटक हैं.

यह वीडियो दस्तावेजों कैसे Miltenyi माउस का उपयोग करने के लिए आईएल 17 स्राव परख - सेल संवर्धन और जांच किट (पीई). जब इस प्रक्रिया कर रही यह महत्वपूर्ण है अपने सेल तैयारी शुरू में आईएल 17-स्रावित कोशिकाओं की आवृत्ति के एक अनुमान है. लेबलिंग और cytokine स्राव अवधि के दौरान उपयुक्त कक्ष एकाग्रता अन्य कोशिकाओं द्वारा अपने निलंबन में पार संदूषण को रोकता है और विश्वसनीय परिणाम भरोसा दिलाते हैं.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE)	Reagent	Miltenyi Biotec	130-094-213	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx
RPMI 1640	Medium	Miltenyi Biotec	130-091-440	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx
CD4-APC	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-611	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx
CD8a-FITC	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-605	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx
Propidium Iodide Solution	Reagent	Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
FcR Blocking reagent, mouse	Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx
Dead Cell Removal Kit	Reagent	Miltenyi Biotec	130-090-101
MACSmix Tube Rotator	Instrument	Miltenyi Biotec	130-090-753	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
gentleMACS™ Dissociator	Instrument	Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
autoMACS Pro Starting Kit	Instrument	Miltenyi Biotec	130-092-545	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx
MACS Columns	Tool	Miltenyi Biotec		http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx
MACS Separator	Tool	Miltenyi Biotec