كشف وعزل خلايا T ماوس قابلة للحياة IL - 17 - الإخفاء

Summary

يصف هذا الإجراء كشف وعزل كريات الدم البيضاء التي تفرز TH17 الماوس بنشاط IL - 17 على التحفيز.

Abstract

إفراز سايتوكاين MACS تكنولوجيا الفحص يتيح الكشف عن السيتوكينات يفرز على مستوى خلية واحدة وعزل الخلايا الحساسة للخلوى - إفراز قابلة للحياة. من أجل تسمية IL - 17 - إفراز الخلايا ، تعليق خلية واحدة من الماوس splenocytes مستعدة وحفزت على 37 درجة مئوية مع سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin للحث على إفراز خلوى. لوقف إفراز الخلايا ثم توضع على الجليد ويتعرضون إلى IL - 17 الكاشف قبض على الضد ثنائية محددة يمكن أن تتحد مع CD45 الموجودة على سطح خلية من الكريات البيض وIL - 17 كما أنها تفرز واشتعلت بالقرب من سطح الخلية. ومن ثم إعادة إفراز بدأت عن طريق زيادة درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية و هي المحاصرين IL - 17 التي الكاشف الصيد. ثم توقف إفراز مرة أخرى ، عن طريق وضع الخلايا على الجليد. للكشف عن IL - 17 المحاصرين ، يتم تحضين الخلايا مع IL - 17 - second محددة الضد مترافق لالبيوتين والأجسام المضادة لمكافحة البيوتين - PE. ويمكن الآن أن تحلل الخلايا مباشرة من التدفق الخلوي أو المعدة لتخصيب اليورانيوم بحلول العزلة ووضع العلامات اللاحقة مع مكافحة PE MicroBeads مترافق.

Protocol

إعداد الكواشف

1. جعل العازلة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة (0.5 ٪) ، و 2 EDTA ملم. لأن فقاعات الهواء يمكن أن تسد أعمدة الفصل MACS ، ويجب أن يكون المخزن وتخزينها في degassed 2-8 درجة مئوية قبل الاستخدام.
2. نستخدم RPMI 1640 تحتوي على 5 ٪ متوسطة المصل الماوس. يجب أن لا يحتوي على مستنبت BSA أو FCS ، وهذه المركبات سوف يغير من خصوصية تحفيز الخلية.
3. وIL - 17 الفحص إفراز ماوس -- إثراء الخلية والكشف عن مجموعة من Miltenyi - بيوتيك. طقم يحتوي على العناصر التالية : وIL - 17 الكاشف الصيد ، وIL - 17 جسم كشفها (البيوتين) والمضادة للبيوتين PE ، وMicroBeads مكافحة PE.

تحفيز Splenocytes

1. يتم تنفيذ هذا البروتوكول في وجود سيطرة السلبية والإيجابية ، مثل splenocytes unstimulated وملون مباين للخلايا T. ويتم هذا البروتوكول خارج باستخدام تقنية معقمة.
2. إعداد تعليق خلية واحدة من الماوس splenocytes التي كانت معزولة باستخدام Dissociator ™ gentleMACS. وينبغي تركيز محدد سلفا من الخلايا عن طريق العد الخلية. بيليه في الخلايا ز × 200 لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. بعد الطرد المركزي ، ونضح طاف بيليه قبالة باستخدام ماصة. لا صب الأنبوب لتجنب فقدان بيليه.
4. الآن ، resuspend الخلايا في مستنبت ثم إضافة إلى البئر. إضافة المتوسطة كافيا لتركيز عشرة ملايين خلية لكل مليلتر وخمسة ملايين الخلايا لكل سم مربع.
5. لتحفيز استجابة مناعية في خلايانا معلق ، ونضيف إلى ionomycin (1 ميكروغرام / مل) ، وسلطة النقد الفلسطينية (10 نانوغرام / مل) على عينة والحل عن طريق مزيج pipetting بلطف صعودا وهبوطا. ثم وصفت الآبار تبعا لذلك.
6. الآن ، فإننا سوف احتضان خلايانا لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية مع عدم وجود خلط لبدء فترة التحفيز. انتقل إلى IL - 17 3 ساعات من بداية التحليل من التحفيز ، والتخطيط لذلك وفقا لذلك.
7. لوقف إفراز ، وتوضع الخلايا على الجليد ونقوم بجمع الخلايا يحفزه pipetting بلطف صعودا ونزولا مع العازلة الباردة. ثم يتم نقل الخلايا من البئر إلى الأنبوب ويتم غسلها للمرة الثانية.
8. لضمان أن يتم جمع كافة الخلايا ، انها فكرة جيدة للتحقق من الطبق الخاص بك تحت المجهر. إذا الخلايا لا تزال المرفقة ، يمكنك جمع الخلايا المتبقية وذلك بدهن الطبق مع العازلة الباردة. ويمكن إزالة أي كتل الخلايا في خلية التعليق الخاص باستخدام مرشحات قبل الانفصال.

وسم خلايا الكاشف مع الصيد

1. من الأهمية بمكان أن نلاحظ أن هذا الفحص يعمل بشكل أمثل إذا كانت أقل من 2 ٪ من IL - 17 - إفراز خلايا موجودة.
2. إذا كان من المتوقع أن تركيز خلايا إفراز IL - 17 لتكون أكبر من 2 ٪ ضبط كميات تبعا لذلك.
   
3. شرك واحد المحتملة من هذا الإجراء هو من التلوث عبر الكاشف الصيد ، والتي يمكن أن تحدث أثناء وضع العلامات عند الأضداد ثنائية محددة تربط إلى خلية T غير إفراز والفخاخ IL - 17 يفرز من الخلايا اللمفاوية المجاورة ، وبالتالي توليد ايجابيات كاذبة.
4. من أجل الالتفاف على هذه المشكلة ، من المهم جدا أن الخلايا يبرد قبل وضع العلامات والعمل مع العازلة الباردة لابطاء انتشار IL - 17 ، وتجنب هذا التلوث عبر. بالإضافة إلى الحفاظ على الخلايا الباردة ، يجب أن تظل عند تركيز محدد.
5. للبدء في إجراءات وضع العلامات ، ونحن نستخدم 10000000 الخلايا في أنبوب 15 مل محكمة السد. إذا كانت أرقام أعلى الخلية لا بد من استخدامها ، ببساطة مقياس كافة وحدات التخزين وفقا لذلك. بمجرد الحصول على تركيز خلية المثلى ، وغسل الخلايا من خلال إضافة 10 مل من العازلة الباردة.
6. تدور باستمرار في خلايا 300 × ز لمدة 10 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي المبردة (2-8 درجة مئوية).
7. بعد الطرد المركزي ، وطاف به نضح تماما ماصة. لا صب وطاف لأن ذلك سيؤدي الى فقدان الخلية وأحجام غير دقيقة. كرر الخطوة الغسيل الذي يتكون من إضافة 10ML العازلة من البرد ، الطرد المركزي ، والطموح.
8. الآن أن لدينا بيليه من النقاء المطلوب ، resuspend الخلايا في 80 ميكرولتر من مستنبت الباردة. لتسمية لهم ، وسوف نضيف الآن 20 ميكرولتر من IL - 17 ماوس الكاشف الصيد.
9. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق على الجليد.
10. بعد فترة حضانة المرض 5 دقائق على الجليد ، وإزالة الأنبوب وتمييع الخلايا في 10 مل من 37 درجة مئوية المتوسط ​​الدافئة. ثم تأمين أنبوب على أنبوب MACSmix الدوار واحتضان الأنبوب في 37 دقيقة لمدة 45 حركة مستمرة تحت درجة مئوية. زيادة درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية وسوف تبدأ إعادة إفراز خلوى.

وسم مع خلايا جسم الكشف IL - 17 (البيوتين) والمضادة للبيوتين PE -

1. بعد فترة 45 دقيقة في إفراز درجة مئوية 37 ، وضع أنبوب فورا على الجليد. سوف يتوقف هذا إفراز خلوى. من هنا على أنه أمر حاسم للحفاظ على الخلايا على الجليد.وسوف تعمل مع العازلة الباردة تجنب التلوث عبر الكاشف للصيد.
2. تملأ أنبوب مع العازلة الباردة والطرد المركزي في 300xg في 2-8 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. وطاف نضح تماما. تكرار غسل خطوة واحدة الى مزيد من الوقت.
3. هو بيليه معلق الخلية في 80 ميكرولتر من المخزن البارد ويوضع أنبوب على الجليد.
4. لتجنب ملزم غير محدد من الأجسام المضادة ، نوصي إضافة الكاشف FCR 10μl الحظر واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. ثم نضيف 20 ميكرولتر من IL - 17 جسم الفأر كشفها (البيوتين) التي يتم مترافق لالبيوتين واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد.
5. مرة أخرى ، وغسل الخلايا كما فعلنا قبل ذلك بإضافة 10 مل من البرد وعازلة في اجهزة الطرد المركزي في 300xg 2-8 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
6. نضح الآن وطاف بيليه resuspend في الخلية في 80 ميكرولتر من العازلة الباردة.
7. إضافة 20 ميكرولتر من الأجسام المضادة لدينا الثانوي ، نظام مضاد للبيوتين - PE.
8. خليط الخلايا والثانوية حل الأضداد ، واحتضان الأنبوب مرة أخرى لمدة 10 دقائق على الجليد.
9. مرة واحدة هذا الاحتضان الثانية كاملة ، يغسل خلايا العازلة مع 10 مل من البرد وأجهزة الطرد المركزي.
10. يمكن الآن أن بيليه معلق في 500 ميليلتر من العازلة الباردة.
11. إذا كانت الخلايا يجب أن تكون مفصولة عن مزيد من التحليل المصب ، يمكن أن يسمى مغناطيسيا مع مكافحة PE - MicroBeads وفصلها يدويا أو آليا باستخدام MACS الأعمدة وفواصل MACS.
12. أكملنا الآن وضع العلامات من splenocytes ونحن على استعداد للتحليل.

تحليل FACS

1. لتحليلنا ، سوف نقوم بمقارنة splenocytes حفز وunstimulated بواسطة التدفق الخلوي.
2. قبل تحليل تدفق cytometric ، ملطخة الخلايا مع يوديد propidium عند 0.5 ميكروغرام / مل إلى بوابة الخروج الخلايا الميتة. تم تحميل محلل ™ MACSQuant مع 200،000 الخلايا لكل عينة ، ونحن الآن بصدد النظر في المؤامرات مبعثر من تفاعل الأضداد النسبي في العينات. اثنين من الاعتبارات الهامة لتحليل الخلايا نادرة -- مثل IL - 17 خلايا ايجابية -- من التدفق الخلوي هي :
   • وضع بوابة على الخلايا الليمفاوية في الأمام مقابل مبعثر الجانب مؤامرة مبعثر
   • وتبوب من الخلايا الميتة (ملطخة يوديد propidium) والخلايا البائية (التي قد تتسبب في تلوين الخلفية غير محددة) لزيادة تعزيز حساسية الكشف
3. استخدمنا CD4 - APC الضد للكشف عن الخلايا التائية والأضداد CD45R/B220-PerCP للكشف عن خلايا B. نرى خصائص مبعثر إلى الأمام والجانب من العينات وتطبيق البوابة على السكان لمفاوية.
4. تم تطبيق بوابة ثانية لرؤية الخلايا الميتة والخلايا الملون ب الملون (Y المحور). ويستثنى من هذه الخلايا لتحليل الخلايا التائية.
5. في هذا المثال ، الذي هو أساسا سيطرتنا سلبية ، يمكننا أن نرى أن هناك IL - 17 CD4 إفراز الإيجابية القليلة جدا في عينات خلايا T unstimulated -- نحو 0.003 ٪ (الشكل 4). أبحث في السكان حفز خلايا T ، يمكننا أن نرى عددا كبيرا من الخلايا التائية CD4 الإيجابية التي تفرز IL - 17 -- نحو 0.367 ٪ (الشكل 5A) قبل الانفصال و60.76 ٪ بعد الفصل المغناطيسي مع تقنية MACS (الشكل 5B).

Discussion

TH17 الخلايا تلعب دورا أساسيا في الحصانة التكيف والاستجابة الالتهابية وتشكل عنصرا رئيسيا في التهاب القيادة الذاتية.

يوثق هذا الفيديو كيفية استخدام الماوس في Miltenyi IL - 17 الفحص إفراز -- إثراء الخلية وكيت كشفها (PE). عندما تفعل هذا الإجراء أنه من المهم أن يكون هناك تقدير وتيرة IL - 17 - إفراز الخلايا في إعداد الخاص خلية البداية. تركيز الخلية المناسبة خلال فترة الوسم وخلوى إفراز يمنع التلوث عبر خلايا أخرى في نظام التعليق الخاص ويضمن نتائج موثوقة.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE)	Reagent	Miltenyi Biotec	130-094-213	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx
RPMI 1640	Medium	Miltenyi Biotec	130-091-440	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx
CD4-APC	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-611	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx
CD8a-FITC	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-605	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx
Propidium Iodide Solution	Reagent	Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
FcR Blocking reagent, mouse	Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx
Dead Cell Removal Kit	Reagent	Miltenyi Biotec	130-090-101
MACSmix Tube Rotator	Instrument	Miltenyi Biotec	130-090-753	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
gentleMACS™ Dissociator	Instrument	Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
autoMACS Pro Starting Kit	Instrument	Miltenyi Biotec	130-092-545	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx
MACS Columns	Tool	Miltenyi Biotec		http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx
MACS Separator	Tool	Miltenyi Biotec