Summary
Traditionellt vertikal skiva och hela montering beredningen av näthinnan har använts för att studera funktionen av retinala kretsar. Här beskriver vi de nya skivning metod för att bevara de dendritiska morfologi av näthinnan nervceller intakt.
Abstract
Traditionellt vertikal skiva och hela montering beredningen av näthinnan har använts till att studera funktionen av retinala kretsar. Men många av näthinnans nervceller, som amakrina celler, utöka sin dendriter horisontellt, så att morfologin av cellerna ska vara allvarligt skadade i den vertikala skivor. I hela montering förberedelser, särskilt för patch-clamp inspelningar, retinal nervceller i mitten lagret är inte lätt åtkomliga på grund av den omfattande täckning av gliacellsmarkörer (Mueller cell) är endfeets. Här beskriver vi de nya skivning metod för att bevara de dendritiska morfologi av näthinnan nervceller intakt. Segmentet gjordes horisontellt på det inre lagret av näthinnan med hjälp av en vibratome slicer efter att näthinnan var inbäddade i låg temperatur smälter agarosgel. I denna horisontella bit beredningen av näthinnan, studerade vi funktionen av näthinnans nervceller jämfört med deras morfologi, med hjälp av patch-clamp inspelning, kalcium bildteknik, immuncytokemiundersökning och encelliga RT-PCR.
Protocol
- Förbered en agar-block (30 mg / ml, dvs 3%, i destillerat vatten). Lös och mikrovågsugn den först och häll det i en glasskål. Håll skålen i kylskåp vid 4 o C.
Tips: agar blocket bör förberedas i förväg.
- Förbered låga temperaturer-smälter agarosgel (25 mg / ml, dvs 2,5%, i medium). Lös och mikrovågsugn den. Förvara den i hett vattenbad vid 35 ° C.
Tips: Håll agarosgel inte för varmt. Om det är för varmt, tar det lång tid att vara stelnat och gelen kan döda näthinnan
. - Euthanize djuret, enucleate en ögonglob och öppna den som en ögonmussla. Till vätskeform glaskroppen, är den öppnade ögonmusslan blöt i 10 min i hyaluronidas på medellång (0,07 mg / ml), om nödvändighet.
- Skär agar i ett block (t.ex., 1 cm x 1,5 cm för mus näthinnan) och stadigt fäst på en vibratome scenen av snabblim. Håll agar blocket vått.
- Placera bladet på 5 grader vid slicer. Försiktigt klippa ovansidan av agar blocket vid en hastighet på ca. 50 ìm / sek, frekv. 50 Hz.
Tips: Se till att ovansidan av agar blocket är helt slät och platt. Flera snitt (minst tre gånger) kan behövas för att få den jämn och plan yta agar blocket.
- Skölj ögonmussla med mediet utan hyaluronidas. Isolera näthinnan från en pigmentepitel och placera den fotoreceptor nedåt på en bit filtrerpapper. För att ordentligt fästa näthinnan till filterpapper, vakuum näthinnan på filterpapper flera gånger.
Tips: Se till att näthinnan är ansluten till filterpapperet helt platt. När du sätter en näthinna på filterpapper, skär den överskjutande filterpappret omger näthinnan (Fig.2A). Överskottet filtrerpapper förhindrar ofta ett blad från att gå i rätt lager av näthinnan.
- Torka försiktigt ut överflödigt medium på agar blocket och försiktigt placera näthinnan på filterpapper på agar blocket. För att ordentligt Placera filterpappret på agar blocket, bifoga snabblim på kanten av filtrerpapper.
Tips: För att undvika unexpectable spricka, placera näthinnan som framst som möjligt på ovansidan av agar blocket.
- Häll försiktigt vid låg temperatur-smältande agarosgel över näthinnan. Vänta 1 min och försiktigt hälla mediet på den för att kyla ner det. Den agarosgel blir stelnade snabbt.
Tips: För varmt agarosgel dödar näthinnan.
- Lyft bladet ställning till flera hundra ìm ovanför ytan av agar blocket och försiktigt skära toppen av stelnat agarosgel.
- Sänk ner bladet position. Skär näthinnan i nivå med den proximala en tredjedel av det inre nukleära lagret (ca mellan 200 och 250 ìm ovanför ytan på agar blocket).
Tips: För mycket hastighet av bladet kommer att skada näthinnan allvarligt. Ca. 50 ìm / sek (50 Hz) är lämplig.
- Observera att amakrina celler nu nedåt. Försiktigt plocka upp den del av näthinnan tillsammans med den stelnat agarosgel och lägg den med framsidan uppåt i en kammare eller en maträtt.
Tips: Eftersom musen näthinnan är liten och vågigt, är det svårt att få en perfekt horisontell skiva vid ett lämpligt lager. En "sned" slice kan vara en alternativ metod för att få den relativa platt bit av näthinnan. För att få sneda skiva, sätta en annan filterpapper mellan näthinnan på filterpapper och agar blocket som visas i Fig.2B. Även om du inte kan förvänta sig en perfekt horisontell skiva, det finns alltid några områden där amakrina cell soma är på ytan av segmentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera viktiga fördelar av den horisontella skiva utarbetandet av näthinnan.
För det första är morfologi av de celler som expanderar dendriter horisontellt, såsom amakrina celler och horisontella celler, bevaras. Det har visat sig att det finns över 20 olika typer av amakrina celler i näthinnan (MacNeil och Masland, 1998), så att det är ganska viktigt att jämföra morfologin av cellerna med fysiologiska fastigheten.
För det andra, i hela montering näthinnan, förhindrar den omfattande täckning av gliacellsmarkörer s endfeets tillgång patch pipetter till amakrina celler. I den horisontella skivor, är soma för amakrina celler som utsätts för ytan av skivor.
Tredje kan kemiska reagenser lätt nå till riktade celler och deras dendriter, eftersom dessa finns på ytan av skivor. Tvätta-och wash-out av kemikalier är snabb och enkel.
För det fjärde är fluorescerande jon avbildning som konventionella kalcium avbildning performable. I den traditionella vertikala skivor eller hela montera näthinnan, aktiveras excitation ljus för avbildning i sig fotoreceptorer. I den horisontella skiva beredning, fotoreceptorer och photopigments helt bort så att det inte finns någon förorening av excitation ljus framkallat artefakter. Dessutom är det signal-brus-förhållande för bildframställning mycket högre eftersom bakgrunden aktivitet fotoreceptorer elimineras. Den största nackdelen med den horisontella skiva preparatet är att vertikala samband mellan fotoreceptorer och celler ganglion klipps så att det inte finns någon visuell information behandling inom segmentet.
Denna teknik kan tillämpas på näthinnan i alla standard djur såsom guldfiskar, mus och kanin (Fig.1B). Metoden för den horisontella skiva kan erbjuda ett alternativt sätt att utreda funktionen av nervceller och nervbanor i näthinnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla experimentella protokoll utfördes enligt National Institutes of Health riktlinjer för djur.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Richard H. Masland och Akimichi Kaneko för att ge oss värdefulla råd och förslag för att fastställa förfarandet för den horisontella skiva utarbetandet av näthinnan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarose L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Low-temperature melting agarose |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | Type I-S, 300 U/mg | |
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | ||
| Microwave | |||
| Hot water bath | 35 °C | ||
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S | |
| MF-Membrane filters | EMD Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 µm |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | ||
| Instant glue | e.g. Alonalpha, Krazy Glu | ||
| 50 mL Syringe | |||
| Syringe filter | EMD Millipore | SX0001300 |
References
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
