Summary
Tradicionalmente, el corte vertical y la preparación de todo el montaje de la retina se han utilizado para estudiar la función de los circuitos de la retina. Aquí se describe la novela de corte método para preservar la morfología dendrítica de neuronas intactas retina.
Abstract
Tradicionalmente, el corte vertical y la preparación de todo el montaje de la retina se han utilizado para estudiar la función de los circuitos de la retina. Sin embargo, muchas de las neuronas de la retina, como las células amacrinas, ampliar sus dendritas horizontalmente, por lo que la morfología de las células se supone que es severamente dañada en los cortes verticales. En la preparación de todo el montaje, sobre todo para las grabaciones de patch-clamp, las neuronas de la retina en la capa del medio no son de fácil acceso debido a la extensa cobertura de las células gliales (células Mueller) endfeets s. Aquí se describe la novela de corte método para preservar la morfología dendrítica de neuronas intactas retina. El corte se hace horizontalmente en la capa interna de la retina, utilizando una máquina de cortar vibratome después de la retina se ha incrustado en la baja temperatura de fusión en gel de agarosa. En esta preparación corte horizontal de la retina, se estudió la función de neuronas de la retina en comparación con su morfología, mediante el uso de patch-clamp grabación, la técnica de imágenes de calcio, inmunocitoquímica, y una sola célula de RT-PCR.
Protocol
- Prepare un bloque de agar (30 mg / ml, es decir, un 3%, en agua destilada). Disolver y microondas por primera vez y se vierte en un recipiente de vidrio. Mantenga el recipiente en el refrigerador a 4 º C.
Consejo: El bloque de agar deben estar preparados de antemano.
- Preparar a baja temperatura de fusión en gel de agarosa (25 mg / ml, es decir, un 2,5%, en media). Disolver y microondas. Mantenerlo en el baño de agua caliente a 35 º C.
Sugerencia: Mantenga el gel de agarosa no demasiado caliente. Si hace demasiado calor, se necesita mucho tiempo para ser solidificada, y el gel se puede matar a la retina
. - La eutanasia de los animales, una enucleación del globo ocular y abrirlo como una ojera. Para licuar el vítreo, el ocular se abre en remojo durante 10 minutos en la hialuronidasa en el medio (0,07 mg / ml), si necesariamente.
- Cortar el agar en un bloque (por ejemplo, 1 cm x 1,5 cm de la retina del ratón) y firmemente en un escenario vibratome de pegamento instantáneo. Mantener el bloque de agar mojado.
- Coloque la hoja en 5 grados en la máquina de cortar. Cortan cuidadosamente la superficie superior del bloque de agar a la velocidad de aprox. 50 m / seg, frecuencia. 50 Hz.
Sugerencia: Asegúrese de que la superficie superior del bloque de agar es totalmente lisa y plana. Varios cortes (al menos 3 veces) puede ser necesaria para obtener la superficie lisa y plana del bloque de agar.
- Enjuague el ocular con el medio sin hialuronidasa. Aislar a la retina de un epitelio pigmentario y fotorreceptores lugar que hacia abajo en un pedazo de papel de filtro. Para fijar firmemente la retina al papel de filtro, el vacío de la retina en el papel de filtro varias veces.
Sugerencia: Asegúrese de que la retina se une al papel de filtro completamente plana. Después de poner una retina en el papel de filtro, cortar el exceso de papel de filtro alrededor de la retina (Fig.2a). El exceso de papel de filtro a menudo impide que una hoja de entrar en la capa adecuada de la retina.
- Limpie con cuidado el medio en exceso en el bloque de agar y se coloca cuidadosamente la retina en el papel de filtro en el bloque de agar. Con firmeza a cabo el papel de filtro en el bloque de agar, colocar pegamento instantáneo en el borde del papel de filtro.
Sugerencia: Para evitar romper unexpectable, el lugar de la retina como el frente como sea posible en la superficie superior del bloque de agar.
- Vierta suavemente el gel de baja temperatura de fusión de agarosa sobre la retina. Esperar durante 1 minuto y con cuidado vierta en el medio a que se enfríe. El gel de agarosa se solidifica rápidamente.
Consejo: Mucho calor en gel de agarosa mata a la retina.
- Levante la posición de la hoja a varios cientos de micras por encima de la superficie superior del bloque de agar y suavemente cortar la parte superior del gel de agarosa solidificada.
- Más abajo en la posición de la hoja. Corte de la retina a nivel de la porción proximal de un tercio de la capa nuclear interna (aprox. entre 200 y 250 m de la superficie superior del bloque de agar).
Consejo: El exceso de velocidad de la hoja puede dañar gravemente la retina. Aprox. 50 m / seg (50 Hz) es la adecuada.
- Tenga en cuenta que las células amacrinas están boca abajo. Recoja cuidadosamente la porción de la retina, junto con el gel de agarosa solidificada y colóquelo boca arriba en una cámara o un plato.
Consejo: Debido a la retina del ratón es pequeño y ondulado, es difícil obtener un corte horizontal perfecto en un nivel apropiado. Un "oblicua" slice puede ser un método alternativo para obtener el trozo relativamente plana de la retina. Para obtener el corte oblicuo, dicho de otro papel de filtro entre la retina en el papel de filtro y el bloque de agar como se muestra en Fig.2b. Aunque no se puede esperar un corte horizontal perfecto, siempre hay algunas áreas en las células amacrinas soma es en la superficie de la división.
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Discussion
Hay varias ventajas importantes de la preparación de corte horizontal de la retina.
En primer lugar, la morfología de las células que se expanden horizontalmente dendritas, como las células amacrinas y células horizontales, se conserva. Se ha demostrado que hay más de 20 tipos de células amacrinas de la retina (MacNeil y Masland, 1998), por lo que es muy importante comparar la morfología de las células con las propiedades fisiológicas.
En segundo lugar, en la retina de todo el montaje, la extensa cobertura de las células gliales endfeets s impide el acceso de las pipetas de patch a las células amacrinas. En los cortes horizontales, el soma de las células amacrinas está expuesto a la superficie de las láminas.
En tercer lugar, los reactivos químicos pueden llegar fácilmente a las células objetivo y sus dendritas, debido a que estos se encuentran en la superficie de las láminas. Lavado y lavado de fuera de los productos químicos son rápidos y fáciles.
En cuarto lugar, la imagen de iones fluorescentes, tales como imágenes de calcio convencional es realizable. En los cortes tradicionales verticales o en la retina de todo el montaje, la luz de excitación para la imagen se activa fotorreceptores. En la preparación de corte horizontal, fotorreceptores y fotopigmentos son totalmente eliminado para que no haya contaminación de luz de excitación evocado por los artefactos. Además, la relación señal-ruido de la imagen es mucho mayor debido a la actividad de fondo de los fotorreceptores se elimina. La mayor desventaja de la preparación de corte horizontal es que la conexión vertical entre los fotorreceptores y las células ganglionares se corta por lo que no hay ningún proceso de información visual dentro de la rebanada.
Esta técnica es aplicable a la retina de los animales tales como peces de colores estándar, el ratón y el conejo (Fig.1b). El método de la corte horizontal puede ofrecer una alternativa en la investigación de la función de las neuronas y los circuitos neuronales de la retina.
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Disclosures
Todos los protocolos experimentales se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices para el uso de animales.
Acknowledgments
Agradecemos a los Dres. Richard H. Masland y Kaneko Akimichi por darnos consejos y sugerencias para establecer el procedimiento de la preparación de corte horizontal de la retina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarose L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Low-temperature melting agarose |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | Type I-S, 300 U/mg | |
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | ||
| Microwave | |||
| Hot water bath | 35 °C | ||
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S | |
| MF-Membrane filters | EMD Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 µm |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | ||
| Instant glue | e.g. Alonalpha, Krazy Glu | ||
| 50 mL Syringe | |||
| Syringe filter | EMD Millipore | SX0001300 |
References
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
