Summary
Traditionell wird der vertikale Scheiben schneiden und die ganze-mount Vorbereitung der Netzhaut verwendet worden, um die Funktion der Netzhaut Schaltkreise zu untersuchen. Hier beschreiben wir den Roman Slicing-Verfahren, um die dendritischen Morphologie der retinalen Nervenzellen intakt zu erhalten.
Abstract
Traditionell wird der vertikale Scheiben schneiden und die ganze-mount Vorbereitung der Netzhaut verwendet worden, um die Funktion der Netzhaut Schaltkreise zu untersuchen. Allerdings sind viele der retinalen Nervenzellen, wie Amakrinzellen, erweitern ihre Dendriten horizontal, so dass die Morphologie der Zellen soll zu stark in den vertikalen Scheiben beschädigt werden. In der ganzen-mount Vorbereitung, insbesondere für Patch-Clamp-Aufnahmen sind Netzhautneuronen in der mittleren Schicht nicht leicht zugänglich durch die umfangreiche Berichterstattung von Gliazellen (Mueller-Zelle) s endfeets. Hier beschreiben wir den Roman Slicing-Verfahren, um die dendritischen Morphologie der retinalen Nervenzellen intakt zu erhalten. Die Scheibe wurde horizontal an der inneren Schicht der Netzhaut mit einem Vibratom Allesschneider gemacht, nachdem der Netzhaut in der Tieftemperatur-Agarose-Gel eingebettet war. In diesem horizontalen Scheibe Vorbereitung der Netzhaut, untersuchten wir die Funktion der Netzhaut Neuronen im Vergleich zu ihrer Morphologie, mit Patch-Clamp-Aufzeichnung, Kalzium-Imaging-Technik, Immunzytochemie und Einzelzell-RT-PCR.
Protocol
- Bereiten Sie eine Agar-Block (30 mg / ml, dh 3%, in destilliertem Wasser). Auflösen und Mikrowelle es zuerst und gießen Sie sie in einer Glasschale. Halten Sie das Gericht in einem Kühlschrank bei 4 ° C.
Tipp: Die Agar-Block sollte im Vorfeld vorbereitet werden.
- Bereiten Sie bei niedrigen Temperaturen schmelzende Agarosegel (25 mg / ml, dh 2,5%, in Medium). Auflösen und Mikrowelle es. Halten Sie es in dem heißen Wasserbad bei 35 o C.
Tipp: Halten Sie das Agarosegel nicht zu heiß. Wenn es zu heiß ist, dauert es eine lange Zeit verfestigt werden, und das Gel kann die Netzhaut zu töten
. - Euthanize das Tier, entkernen einen Augapfel, und öffnen Sie es als eine Augenmuschel. Zu verflüssigen Glaskörper, ist die geöffnete Augenmuschel für 10 min in Hyaluronidase in das Medium (0,07 mg / ml) getränkt, wenn nötig.
- Schneiden Sie das Agar in einen Block (zB, 1 cm x 1,5 cm für Maus Netzhaut) und fest auf einem Vibratom Bühne von Sekundenkleber befestigt. Halten Sie die Agarblock nass.
- Legen Sie das Blatt bei 5 Grad an der Schneidemaschine. Vorsichtig schnitt die Oberfläche des Agar-Block mit einer Geschwindigkeit von ca.. 50 mu m / sec, Freq. 50 Hz.
Tipp: Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des Agar-Block völlig glatt und eben ist. Mehrere Schnitte (mindestens 3-mal) erforderlich sein, um die glatte und ebene Oberfläche des Agar-Block zu bekommen.
- Spülen Sie die Augenmuschel mit dem Medium ohne Hyaluronidase. Isolieren Sie die Netzhaut aus einer Pigmentepithel und legen Sie sie Photorezeptor-Seite nach unten auf ein Stück Filterpapier. Um fest an der Netzhaut auf das Filterpapier, Vakuum der Netzhaut auf dem Filterpapier mehrmals.
Tipp: Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut auf das Filterpapier vollständig flach ist beigefügt. Nachdem Sie eine Netzhaut setzen auf dem Filterpapier, schneiden Sie die überschüssige Filterpapier Umgebung der Netzhaut (Abb. 2a). Der Überschuss Filterpapier verhindert oft eine Klinge aus, die in der entsprechenden Schicht der Netzhaut.
- Wischen Sie das überschüssige Medium auf die Agar-Block und vorsichtig die Netzhaut auf dem Filterpapier auf die Agar-Block. Um einen festen Platz das Filterpapier auf die Agar-Block legen Sekundenkleber am Rand des Filterpapiers.
Tipp: Um zu vermeiden, Unerwartete crack, Ort der Netzhaut wie vor als möglich auf der Oberseite des Agar-Block.
- Vorsichtig gießen Sie die niedrigen Temperaturen schmelzende Agarosegel über die Netzhaut. Warten Sie 1 min und gießen Sie leicht das Medium auf, um es abzukühlen. Das Agarosegel verfestigt schnell.
Tipp: Zu heiß Agarosegel tötet die Netzhaut.
- Nehmen Sie die Klinge der Lage, mehrere hundert um über die Oberfläche des Agar-Block und sanft schneiden Sie die Spitze des erstarrten Agarosegel.
- Weiter unten die Klinge Position. Cut der Netzhaut auf der Ebene des proximalen ein Drittel der inneren Körnerschicht (ca. zwischen 200 und 250 pm oberhalb der oberen Oberfläche des Agar-Block).
Tipp: Zu viel Geschwindigkeit des Blattes wird die Netzhaut stark beschädigen. Ca. 50 mu m / sec (50 Hz) geeignet ist.
- Beachten Sie, dass die Amakrinzellen jetzt verdeckt sind. Sorgfältig nehmen die Scheibe der Netzhaut zusammen mit der erstarrten Agarosegel und legen Sie sie offen in eine Kammer oder ein Gericht.
Tipp: Da die Maus Netzhaut ist winzig und wellig, ist es schwierig, eine perfekte horizontale Scheibe an einer geeigneten Schicht zu erhalten. Eine "schräge" Scheibe kann eine alternative Methode, um die relative flache Scheibe der Netzhaut zu erhalten. Um die schrägen Scheibe, anders Filterpapier in zwischen der Netzhaut auf dem Filterpapier und die Agar-Block wie in Fig. 2B gezeigt. Obwohl Sie nicht erwarten können eine perfekte horizontale Scheibe, gibt es immer einige Bereiche, in denen amakrinen Zelle soma ist auf der Oberfläche der Scheibe.
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Discussion
Es gibt mehrere wichtige Vorteile der horizontalen Scheibe Vorbereitung der Netzhaut.
Zunächst wird die Morphologie der Zellen, die Dendriten erweitern horizontal wie Amakrinzellen und horizontale Zellen, erhalten. Es hat sich gezeigt, dass es über 20 Arten von Amakrinzellen in der Netzhaut (MacNeil und Masland, 1998), so dass es ganz wichtig ist, die Morphologie der Zellen mit der physiologische Eigenschaft zu vergleichen.
Zweitens, in der ganzen-mount Netzhaut verhindert, dass die umfangreiche Berichterstattung von Gliazellen s endfeets den Zugang der Patch-Pipetten zur Amakrinzellen. In der horizontalen Schnitte ist die Soma der Amakrinzellen an die Oberfläche der Scheiben ausgesetzt.
Drittens können chemische Reagenzien leicht an Zielzellen und ihre Dendriten erreichen, da diese auf der Oberfläche der Scheiben befinden. Wash-in-und Wash-out von Chemikalien sind schnell und einfach.
Viertens ist fluoreszierende Ionen-Bildgebung wie herkömmliche Kalzium-Imaging aufführbar. In der traditionellen senkrechten Scheiben oder das gesamte-mount Netzhaut aktiviert Anregungslicht für die Bildgebung selbst Photorezeptoren. In der horizontalen Scheibe Vorbereitung sind Photorezeptoren und Photopigmente vollständig entfernt, so dass es keine Verschmutzung der Anregungslicht hervorgerufenen Artefakte. Darüber hinaus ist das Signal-Rausch-Verhältnis von bildgebenden viel höher, weil der Hintergrund-Aktivität von Photorezeptoren ist eliminiert. Der größte Nachteil der horizontalen Scheibe Zubereitung ist, dass die vertikale Verbindung zwischen Photorezeptoren und Ganglienzellen ist so, dass es keine visuelle Informationsverarbeitung innerhalb der Scheiben schneiden.
Diese Technik ist anwendbar auf die Netzhaut eines Standard-Tiere wie Goldfische, Maus und Kaninchen (Abb. 1b). Die Methode der horizontalen Scheibe kann einen alternativen Weg bei der Untersuchung der Funktion von Neuronen und neuronalen Schaltkreisen in der Netzhaut zu bieten.
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Disclosures
Alle experimentellen Protokolle wurden nach Angaben des National Institutes of Health Richtlinien für Tierversuche durchgeführt.
Acknowledgments
Wir danken Drs. Richard H. Masland und Akimichi Kaneko, dass sie uns wertvolle Hinweise und Anregungen an das Verfahren der horizontalen Scheibe Vorbereitung der Netzhaut zu etablieren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarose L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Low-temperature melting agarose |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | Type I-S, 300 U/mg | |
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | ||
| Microwave | |||
| Hot water bath | 35 °C | ||
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S | |
| MF-Membrane filters | EMD Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 µm |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | ||
| Instant glue | e.g. Alonalpha, Krazy Glu | ||
| 50 mL Syringe | |||
| Syringe filter | EMD Millipore | SX0001300 |
References
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
