Summary
Traditioneel worden de verticale doorsnede en de hele-mount voorbereiding van het netvlies zijn gebruikt om de functie van het netvlies circuits te bestuderen. We beschrijven hier de nieuwe snijden methode om de dendritische morfologie van het netvlies neuronen intact te behouden.
Abstract
Traditioneel worden de verticale doorsnede en de hele-mount voorbereiding van het netvlies zijn gebruikt om de functie van het netvlies circuits te bestuderen. Echter, veel van retinale neuronen, zoals amacrine cellen, horizontaal uit te breiden hun dendrieten, zodat de morfologie van de cellen wordt verondersteld te zwaar beschadigd in de verticale plakjes. In de hele-mount voorbereiding, in het bijzonder voor patch-clamp opnames, retinale neuronen in de middelste laag zijn niet gemakkelijk toegankelijk zijn als gevolg van de uitgebreide dekking van de glia cel (Mueller cel) s endfeets. We beschrijven hier de nieuwe snijden methode om de dendritische morfologie van het netvlies neuronen intact te behouden. De slice is horizontaal gemaakt op de binnenste laag van het netvlies met behulp van een vibratome slicer na het netvlies was ingebed in de lage temperatuur smeltende agarosegel. In deze horizontale plak de voorbereiding van het netvlies, bestudeerden we de functie van retinale neuronen in vergelijking met hun morfologie, met behulp van patch-clamp-opname, calcium beeldvormende techniek, immunocytochemie, en single-cell RT-PCR.
Protocol
- Bereid een agar blok (30 mg / ml, dat wil zeggen 3%, in gedestilleerd water). Ontbinden en magnetron het eerst en giet het in een glazen schaaltje. Hou de schotel in de koelkast bij 4 ° C.
Tip: De agar blok moet worden voorbereid op voorhand.
- Bereid lage temperatuur smeltende agarose gel (25 mg / ml, dat wil zeggen 2,5%, in medium). Ontbinden en magnetron het. Houd het in het hete waterbad bij 35 ° C.
Tip: Houd de agarosegel niet te heet. Als het te warm is, duurt het een lange tijd te zijn gestold, en de gel kan doden het netvlies
. - Euthanaseren het dier, ophelderen een oogbol en open het als een oogschelp. Naar vloeibaar glasvocht, is de geopende oogschelp geweekt gedurende 10 min. in hyaluronidase in het medium (0,07 mg / ml), indien noodzakelijk.
- Snijd de agar in een blok (bijv. 1 cm x 1,5 cm voor muis netvlies) en stevig bevestigd op een vibratome stadium door onmiddellijke lijm. Houd de agar blok nat.
- Plaats het mes bij 5 graden op de snijmachine. Voorzichtig snijd de bovenkant van de agar blok met de snelheid van ca. 50 pm / sec, freq. 50 Hz.
Tip: Zorg ervoor dat de bovenkant van de agar blok is helemaal glad en plat. Verschillende sneden (minstens 3 keer) kan nodig zijn om de gladde en vlakke oppervlak van de agar blok te krijgen.
- Spoel de oogschelp met het medium zonder hyaluronidase. Isoleer het netvlies van een pigment epitheel en plaats het fotoreceptor-kant naar beneden op een stuk filtreerpapier. Stevig het netvlies hechten aan het filterpapier, vacuüm het netvlies op de filtreerpapier meerdere malen.
Tip: Zorg ervoor dat het netvlies is verbonden aan de filtreerpapier volledig plat. Nadat je een netvlies op het filter papier, knip de overtollige filtreerpapier rond het netvlies (fig. 2a). De overmaat filter papier voorkomt vaak een mes uit te gaan in de juiste laag van het netvlies.
- Veeg de overtollige medium op de agar blok en zorgvuldig het netvlies plaats op de filter papier op de agar te blokkeren. Stevig plaatsen van de filter papier op de agar te blokkeren, sluit direct lijm op de rand van het filter papier.
Tip: Om te voorkomen dat unexpectable kraken, het netvlies plaats vooraan als mogelijk op de bovenkant van de agar te blokkeren.
- Giet de lage-temperatuur-smeltend agarose gel over het netvlies. Wacht op 1 min en voorzichtig het medium giet er op om af te koelen. De agarosegel wordt al snel gestold.
Tip: Te heet agarosegel doodt het netvlies.
- Til het blad staat tot enkele honderden micrometer boven de oppervlakte van de agar blok en zachtjes snijd de bovenkant van het gestolde agarose gel.
- Lager het blad positie. Snijd het netvlies op het niveau van de proximale een derde van de binnenste nucleaire laag (ongeveer tussen 200 en 250 micrometer boven de oppervlakte van de agar blok).
Tip: Te veel snelheid van het mes schade zal toebrengen aan het netvlies ernstig. Ca. 50 micrometer / sec (50 Hz) geschikt is.
- Merk op dat de amacrine cellen zijn nu naar beneden. Voorzichtig pak je de plak van het netvlies, samen met de gestolde agarose gel en plaats deze zijde naar boven in een kamer of een schotel.
Tip: Omdat de muis netvlies is klein en golvend, is het moeilijk om een perfecte horizontale slice te verkrijgen op een juiste laag. Een "schuin" slice kan een alternatieve methode om de relatieve vlakke deel van het netvlies te krijgen. Om de schuine stuk, zet een ander filtreerpapier tussen het netvlies op het filter papier en de agar blok zoals weergegeven in Fig.2B. Hoewel je kunt niet verwachten dat een perfect horizontale slice, er zijn altijd enkele gebieden waar amacrine cel soma is op het oppervlak van de slice.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn een aantal belangrijke voordelen van de horizontale plak voorbereiding van het netvlies.
Eerste, is de morfologie van de cellen die dendrieten uit te breiden horizontaal, zoals amacrine cellen en horizontale cellen, bewaard gebleven. Het is aangetoond dat er meer dan 20 soorten amacrine cellen in het netvlies (MacNeil en Masland, 1998), zodat het is heel belangrijk voor de morfologie van de cellen te vergelijken met de fysiologische eigenschap.
Ten tweede, in de hele-mount netvlies, de uitgebreide dekking van endfeets gliale cellen en voorkomt dat de toegang van patch pipetten te amacrine cellen. In de horizontale plakken, is het soma van amacrine cellen blootgesteld aan het oppervlak van de schijfjes.
Ten derde kan chemische reagentia gemakkelijk om gerichte cellen en hun dendrieten, omdat deze zich bevinden op het oppervlak van de schijfjes. Wash-in en wash-out van chemicaliën zijn snel en gemakkelijk.
Ten vierde, TL-ion beeldvorming zoals conventionele calcium beeldvorming is uitvoerbaar. In de traditionele verticale plakken of het hele-mount netvlies, excitatie licht voor het afbeelden van zichzelf activeert fotoreceptoren. In de horizontale slice voorbereiding, zijn fotoreceptoren en photopigments volledig verwijderd, zodat er geen besmetting van excitatie licht opgeroepen artefacten. Daarnaast is de signaal-ruis verhouding van beeldvorming is veel hoger, omdat de achtergrond activiteit van fotoreceptoren wordt geëlimineerd. Het grootste nadeel van de horizontale slice voorbereiding is dat de verticale verbinding tussen fotoreceptoren en ganglion cellen is, zodat er geen visuele informatie verwerking in de slice gesneden.
Deze techniek is van toepassing op het netvlies van elke standaard dieren, zoals goudvissen, de muis en konijn (Fig.1B). De methode van de horizontale slice kan bieden een alternatieve manier bij het onderzoek naar de functie van neuronen en neurale circuits in het netvlies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle experimentele protocollen werden uitgevoerd volgens de National Institutes of Health richtlijnen voor het gebruik van dieren.
Acknowledgments
Wij danken Drs. Richard H. Masland en Akimichi Kaneko voor het geven van ons waardevolle adviezen en suggesties om de procedure van de horizontale plak voorbereiding van het netvlies vast te stellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarose L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Low-temperature melting agarose |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | Type I-S, 300 U/mg | |
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | ||
| Microwave | |||
| Hot water bath | 35 °C | ||
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S | |
| MF-Membrane filters | EMD Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 µm |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | ||
| Instant glue | e.g. Alonalpha, Krazy Glu | ||
| 50 mL Syringe | |||
| Syringe filter | EMD Millipore | SX0001300 |
References
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
