Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

Summary

Dieses Video zeigt, wie Morpholino-oder mRNA in Zebrafisch-Embryonen können bei der Ein-Zell-Stadium zu verringern oder zu erhöhen das Niveau der spezifischen Genprodukte bei der späteren Entwicklung injiziert werden.

Abstract

Einer der Vorteile eines Studiums Zebrafisch ist die Leichtigkeit und Schnelligkeit der Bearbeitung Protein-Spiegel in den Embryo. Morpholinos, die synthetische Oligonukleotide mit Antisense Komplementarität zur Ziel-RNAs sind, kann der Embryo hinzugefügt werden, um die Expression eines bestimmten Gens Produkt zu reduzieren. Umgekehrt können verarbeitet mRNA um den Embryo hinzugefügt werden, um Werte eines Gens zu erhöhen. Das Fahrzeug zum Hinzufügen entweder mRNA oder Morpholino, um einen Embryo ist die Mikroinjektion. Mikroinjektion ist eine effiziente und schnelle, sodass für die Injektion von Hunderten von Embryonen pro Stunde. Dieses Video zeigt alle Schritte in Mikroinjektion beteiligt. Kurz gesagt, werden Eier sofort nach der Verlegung gesammelt und gegen einen Objektträger in eine Petrischale ausgekleidet. Als nächstes wird ein spitzen Nadel mit Injektionsmaterial bestückt mit einem Mikroinjektor und eine Luftquelle verbunden, und die Mikroinjektor Bedienelemente sind angepasst, um eine wünschenswerte Injektionsvolumen zu produzieren. Schließlich wird die Nadel in die Embryos Eigelb getaucht und die Morpholino-oder mRNA ist ausgeschlossen.

Protocol

Teil 1: Egg Produktion und Sammlung

1. Die Nacht vor der Injektion, richten Sie den Fisch in Zuchtbecken mit Trennwänden in Platz. Zur Erhöhung der Gesamtzahl der Eierproduktion, können die Fische in einem Verhältnis von zwei Frauen eingestellt werden, um ein Männchen, falls gewünscht.
2. Am nächsten Morgen, nach der Raumbeleuchtung eingeschaltet, ziehen Sie den Teilern von mehreren Tanks und damit für etwa 20 Minuten ungestört Paarungszeit.
3. Mit einem Sieb, sammeln die Eier aus der Zucht Käfige und spülen Sie sie mit Ei Wasser. Gießen Sie die Eier in einer Petrischale mit Ei Wasser und entfernen unbefruchteten Eiern und Schmutz mit einem Transfer-Pipette. Fische können in größeren Tanks zusammengefasst werden, um zusätzliche Runden von Eiern für die Injektion zu produzieren. Passen Sie den Zeitpunkt der Entnahme der Eizellen, um eine maximale Anzahl von Eiern, ohne dass sie passieren die einzelnen Zell-Stadium hergestellt werden können.
4. Legen Sie einen Objektträger in der umgekehrten Deckel eines 100mm Petrischale. Verwenden Sie einen Transferpipette antreten die Eier gegen die Seite des Schiebers bilden eine einzelne Spalte. Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus dem Ei gleiten durch Drücken einer Kimwipe gegen die gegenüberliegende Seite der Eier. (Abbildung 1A)

Teil 2: Nadel ziehen, Lade-und Vorbereitung

1. Mit einer Mikropipette Abzieher, ziehen Sie einen 1,0 mm OD Glaskapillare in zwei Nadeln und an einem 150mm Petrischale indem über Silly Putty Rampen. Needles kann im Voraus gezogen werden.
2. Backload die Nadel mit 3 ul von Injektionsmaterial mit einem Microloader Pipette. Schütteln Sie die Bolus in Richtung der Nadelspitze bis es wenige oder gar keine Blasen mehr vorhanden sind.
3. Schalten Sie die Luftquelle und Mikroinjektor. Legen Sie die Nadel in die Mikroinjektor und versichern eine gute Abdichtung innerhalb des Gehäuses. Prüfen Sie, ob der Mikromanipulator in eine geeignete Position, um für eine breite Palette von Bewegung und Anpassung zu ermöglichen. Bringen Sie die Nadelspitze in die Ebene der Sicht des Mikroskops, hoch über der Bühne, und konzentrieren sich auf die dünnste Bereich der Spitze. Verwenden Sie ein Paar scharfe Zange kneifen Sie die Nadel an einem Punkt, der die Nadel schmal genug zu durchdringen das Chorion und Dotter, aber immer noch der Lage, eine konsistente Perlgröße Blätter. Ein Tropfen Mineralöl auf einem Mikrometer können verwendet werden, um die Lautstärke der einzelnen Injektion zu berechnen. Wenn in das Öl eingespritzt wird, enthält eine Perle mit einem Durchmesser von 0,1 mm 500 pL von Injektionsmaterial (Abbildung 1B); Injektionsvolumina von 500 pL oder 1nL werden üblicherweise verwendet. Drücken Sie das Fußpedal und überwachen die Größe der Raupe beim Trimmen der Nadel und die Anpassung der Einspritzdruck je nach Bedarf. Ideal Injektionsvolumina füllt ca. 10% des Eies Volumen. Die Qualität der Nadelspitze ist von entscheidender Bedeutung, um sowohl die einfache Injektion und die Qualität und Konsistenz der Ergebnisse.

Teil 3: Injection

1. Sicherstellen, dass die Embryonen nicht über die Vier-Zellen-Stadium entwickelt. Idealerweise sollte Embryonen im Ein-Zell-Stadium werden.
2. Senken Sie die Nadel auf die Spalte von Eiern, hält das Gericht an Stelle mit der anderen Hand.
3. Pierce die Oberfläche des Chorion und geben Sie das Eigelb in einem gleichmäßigen Lauf, während Sie für jede Brechen oder Reißen der Dottersacks. Spritzen Sie das Injektionsmaterial in den Dotter (Abbildung 1C). Vermeiden Sie die Injektion von Luftblasen oder Strecken der Dotter entweder kann tödlich sein, um den Embryo. Arbeiten auf der ganzen Linie, stellen Sie den Druck wie nötig, um eine konsistente Perle Größe und mit einer Pipettenspitze zu erhalten, entfernen Sie die Eier unbefruchtet schauen oder während der Injektion zerstört.
4. Nach Abschluss einer Säule von Eiern, mit einem sanften Strom von Ei-Wasser in den injizierten Eier in eine saubere Petrischale bewegen. Bei Bedarf wiederholen. Halten Sie mehrere injizierten Embryonen als Kontrolle. Am Ende des ersten Tages, entfernen abgestorbene Embryonen und notieren Sie die Anzahl der injizierten Embryonen. Ersetzen Sie das Ei Wasser in die Schüssel in regelmäßigen Abständen, um die Chance einer Infektion zu verringern.

Teil 4: Repräsentative Ergebnisse

Je nachdem, was wird gespritzt haben, kann Embryonen mit einer niedrigeren Rate als ihre injizierten Geschwister überleben. Glücklicherweise ist es einfach, eine große Anzahl von ihnen injizieren, so ist dies selten ein Problem. Es ist normal, morphants leicht verzögerte Entwicklung aufweisen können.

Zur Veranschaulichung der Ergebnisse der Mikroinjektion, haben wir dieses Protokoll auf ein Niveau des Proteins Heart of Glass (HEG) zu manipulieren. Heg ist ein Transmembranprotein für normale Entwicklung des Herzens notwendig. In seiner Abwesenheit zu entwickeln Embryonen Herzen mit riesigen Zustrom Traktate und Kammern ^1. Wir injizierten zwei bisher unbeschriebene Morpholinos gegen heg, heg_e3i3_egfr1 und heg_e4i4_egfr2, bei einer Konzentration von 500 uM. Bei 2 Tage nach der Befruchtung, werden die injizierten Geschwister steuert normal, wie erwartet (Abb. 2A und B). Embryonen mit heg_e3i3_egfr1 gespritzt haben Hirnödem (Abbildung 2C). Obwohl die Herzen der meisten dieser morphants Morphologie verändert haben, sind ihre Kammern normal dimensionierte (Abbildung 2D). Embryonen injiziertmit heg_e4i4_egfr2 weisen variable Herzfehler. Manche erscheinen normal, während andere große Zustrom Traktate und mäßig vergrößert Vorhöfen (Abb. 2E und F) haben. Die HEG-Mutante, wie zuvor ¹ berichtet, hat eine enorm vergrößerte Einflusstrakt und Atrium (Abb. 2G-und H).

Wir haben auch Wildtyp-Embryonen mit 400 ng / ul mRNA aus voller Länge heg cDNA umgeschrieben injiziert. Während injizierten Kontrollen normal entwickeln (Abb. 3A und B), Embryonen mit heg mRNA weisen ein Spektrum von Phänotypen von Wildtyp-Auftritt zu schweren Zyklopie injiziert, Verkürzung der Hauptteil Achse, Nekrose des Kopfes und des Körpers, und Spaltbildungen (Abbildung 3C und D).

Abbildung 1. Embryonen injiziert werden gegen einen Objektträger in eine Petrischale (A) gefüttert. Injektionsvolumen wird durch Injektion in Mineralöl auf einem Mikrometer platziert bestimmt. Ein Injektionsvolumen von 500 pL, die üblicherweise verwendet wird, hat einen Durchmesser von 0,1 mm (B). Unmittelbar nach der Injektion wird der Morpholino-oder mRNA sichtbar als punctuate Ort in den Dotter (C).

Abbildung 2. Nach 2 Tagen nach der Befruchtung haben injizierten Embryonen keine grobe Mängel (A) oder Herz-Phänotyp (B). Embryonen mit dem Morpholino heg_e3i3_egfr1 gespritzt haben Hirnödem (C, Pfeil), aber in der Regel großen Herzkammern (D). Einige Embryonen mit dem Morpholino heg_e4i4_egfr2 gespritzt haben vergrößerten Zufluss Traktate und Vorhöfe (E, F). HEG-Mutanten eine stark vergrößerte Zufluss Traktate und Vorhöfe (G, H). (A), (C), (E) und (G) sind 4x DIC Bilder; (B), (D), (F) und (H) sind 20x DIC Bilder. a = Atrium, it = Einflusstrakt.

Abbildung 3. Nach 24 Stunden nach der Befruchtung, nicht injizierten Embryonen haben einen langen, geraden Körper ohne Nekrose oder Spaltbildungen (A) und zwei klar definierte Augen mit einem Neuralrohr zwischen ihnen (B). Einige Embryonen mit heg mRNA injiziert, zeigen dagegen eine verkürzte Körperachse, Nekrose, deformierte Somiten (C), und Zyklopie (D). (A) und (C) sind 4x DIC Bilder; (B) und (D) sind 20x DIC Bilder.

Discussion

Eine der Stärken des Zebrafisch-Modell ist die Leichtigkeit, mit der bestimmte Genprodukte hinzugefügt werden können oder eliminiert aus dem Embryo durch Mikroinjektion. Um ubiquitär überexprimieren ein bestimmtes Protein, das mRNA ist es in den Dotter an der 1-Zell-Stadium injiziert. Während des Embryos weitere Entwicklung wird die RNA in der gesamten Organismus verteilt und übersetzt. Umgekehrt an ein bestimmtes Protein zu beseitigen, sind Morpholinos verwendet. Morpholinos werden synthetische Oligonukleotide mit Antisense-Komplementarität auf bestimmte RNAs konzipiert. Wie mRNAs sind Morpholinos in den Dotter an der 1-Zell-Stadium injiziert. Im Inneren des Embryos binden sie ihre Ziel-RNAs, die Verhütung Übersetzung.

Die wichtigste Änderung, die für jede Morpholino-oder mRNA vorgenommen werden muss, ist die Konzentration des injizierten Materials. Eine zu hohe Konzentration von entweder Morpholino-oder mRNA kann unspezifische Toxizität, während jeder Morpholino muss empirisch überprüft werden, um seine optimale Konzentration, in der Regel Morpholino-Konzentrationen zwischen 200 um und 500 um festzustellen, knock down Genaktivität effektiv, ohne dass nicht-spezifische Defekte. Die genaue Größe der Nadel Öffnung ist nicht entscheidend. Innerhalb eines Bereichs von Nadelgrößen, Einspritzdruck und Einspritzzeitpunkt können angepasst werden, um ein Bolus von der richtigen Lautstärke zu produzieren.

Morpholinos haben viele Anwendungen, einschließlich der funktionalen Zerlegung der Domänen innerhalb eines Proteins. Wenn entwickelt, um spezifische Exon-Intron-Übergänge Ziel wird Morpholinos Spleißen von dort vorkommenden verhindern. Wir untersuchten die Auswirkungen von zwei Morpholinos binden Exon-Intron-Übergänge in der prä-mRNA von heg. Der Morpholino heg_e3i3_egfr1 bindet die Verbindung zwischen Exon 3 und Intron 3, verhindert das Spleißen Maschinen aus Einbeziehung Exon 3 zu reifen Transkripte. Der Morpholino heg_e4i4_egfr2 ähnlich entfernt Exon 4. Beide Exons 3 und 4 kodieren Domains mit EGF-ähnliche Wiederholungen. Einige Embryonen mit heg_e4i4_egfr2 mäßig Phänokopie der Mutante injiziert; weitere Experimente erforderlich, um die Rolle der Heg Exon 4 in die Entwicklung des Herzens zu verstehen. Überraschenderweise wurden Embryonen mit heg_e3i3_egfr1 injiziert Hirnödem, ein Feature nicht in heg Mutanten zu sehen. Dies kann darauf zurückzuführen sein, die Fähigkeit der Morpholinos von Müttern Transkripte, die nicht betroffen sein würde in zygotischen Mutanten binden.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Microinjector	Tool	Harvard Apparatus	PLI 100
Micromanipulator	Tool	Narishige International	MN 153
Needle Puller	Tool	Sutter Instrument Co.	P 97
Glass Capillaries	Tool	World Precision Instruments, Inc.	TW100 F6
Microloader Pipettes	Tool	Eppendorf	5242956.003
Needle Holder	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH310