Summary
Met behulp van hoogfrequente elektrische stimulatie, beslag-achtige activiteit kan worden geïnduceerd in
Abstract
Drosophila melanogaster is een nuttig instrument voor het bestuderen van aanvallen achtige activiteit. Een verscheidenheid van mutanten waarin de epileptische aanvallen kunnen worden opgewekt door middel van zowel fysieke schokken of elektrische stimulatie is beschikbaar voor onderzoek naar verschillende aspecten van epileptische activiteit en gedrag. Alle vliegen, waaronder wild-type, zal ondergaan aanvallen-achtige activiteit indien gestimuleerd op een voldoende hoog voltage. Inbeslagneming achtige activiteit is een alles-of-niets-reactie en elk genotype heeft een specifieke drempel voor epileptische aanvallen. De drempel voor epileptische aanvallen van een bepaald genotype van vliegen kan worden veranderd door een behandeling met een medicijn of door genetische onderdrukking of verbetering. De drempel is gemakkelijk te meten door de elektrofysiologie. Inbeslagneming-achtige activiteit kan worden opgewekt via hoogfrequente elektrische stimulatie rechtstreeks geleverd aan de hersenen en opgenomen via de dorsale longitudinale spieren (DLMS) in de thorax. De DLMS worden geïnnerveerd door een deel van de reus vezel systeem. Te beginnen met lage spanning, hoge frequentie stimulatie, en daarna het verhogen van de spanning in kleine stappen, kan de drempel voor epileptische aanvallen voor een enkele vlieg worden gemeten.
Protocol
Specimen Bereiding:
De nacht voor het experiment, mannelijke vliegen van de gewenste genotype worden verdoofd en in een flacon met een zachte nylon plug. Een katoenen bal zou ook werken. Na verdoving, de inbeslagneming drempel wordt gewijzigd, zodat de vliegen het best gedurende ten minste zes uur, maar 's nachts ideaal is.
Op de dag van het experiment, zijn de vliegen gemonteerd een voor een op glas dia's met een laag van tandheelkundige wax aan een kant.
Een enkele vlieg wordt opgepikt door het hoofd met een 23 gauge naald (met de scherpe punt cut off) gekoppeld aan een vacuüm lijn.
De vlieg wordt dan aangebracht op de wax op de dia door op de poten en de vleugels in de was.
Zodra de vlieg is geïmmobiliseerd, is wax geduwd rond de nek en de ogen volledig te immobiliseren het hoofd.
Elektrofysiologie:
De vlieg, die nu gemonteerd en klaar om te gaan is geplaatst in de elektrofysiologie opgericht.
De elektrofysiologie set bestaat uit drie sets van micromanipulators, elk met een of twee geslepen bevestigd wolfraamelektroden. Spanning wordt geleverd door een stimulator die is aangesloten op een isolatie-eenheid verbonden aan de stimulatie-elektroden. De registratie-elektrode is aangesloten op een pre-amp die op zijn beurt is bevestigd aan een digitale geheugen oscilloscoop. Hoewel het niet essentieel is, is het nuttig om een luidspreker aangesloten op de oscilloscoop, zodat de antwoorden kunnen worden hoorbaar gemaakt.
Een massa-elektrode is ingebracht in de buik van de vlieg.
De opname elektrode wordt ingebracht in een van de Dorsale Longitudinale spieren in de borstkas van de vlieg.
De stimulatie-elektroden worden ingebracht in het hoofd. Een aan de zijkant van elk oog.
De stimulator moet de volgende instellingen om te beginnen: Continu puls interval van 2 seconden tussen elke puls. Er mag geen vertraging zijn pols. De pulsbreedte moet worden 0.2ms.
De oscilloscoop moet de opslag-functie ingeschakeld en hebben de volgende instellingen: Time / DIV moet worden ingesteld op 1ms/DIV. De Volt / DIV moet worden ingesteld op een van beide 0.1V/DIV of 50 mV / DIV.
De reus vezel drempel wordt bepaald door het leveren van enkele pulsen en wijzend op de minimale spanning nodig is om een antwoord te krijgen. Deze spanning is meestal rond 2 V.
Zodra de reus vezel drempel is vastgesteld, stopt het pulseren van de vliegen en de instellingen op de oscilloscoop aan: 0.2 S / DIV
De instellingen op de stimulator moet worden gewijzigd in: De puls interval moet worden ingesteld op single. De trein moet worden ingeschakeld en ingesteld op 3 seconden. De golfvorm parameters zijn: 0,5 ms pulsen bij 200 Hz voor 300 ms. De spanning wordt gewijzigd in de gewenste instelling en een hoge frequentie trein van pulsen wordt geleverd aan de hersenen van de vlieg.
Als een aanval niet wordt veroorzaakt, zal de oscilloscoop trace tonen een vlakke lijn na de trein. Als de instellingen zijn snel terug naar het startpunt in te stellen, zal de single pulsen veroorzaken een reactie in het grote fiber-systeem.
Als er een aanval wordt opgewekt, de oscilloscoop zal de aanval-achtige activiteit vertonen na de trein. Als de instellingen zijn snel terug geschakeld naar de oorspronkelijke instellingen, zal de ene pulsen niet tot een reactie in het grote fiber-systeem te activeren.
De vliegen hebben een refractaire periode na een hoog-frequente stimulus wavetrain waarin aanvallen als activiteit niet kan worden geïnduceerd. Als er geen aanval optreedt zijn de vliegen vuurvaste voor ongeveer 7 minuten. Als er een aanval wordt opgewekt, de vliegen hebben een refractaire periode van ongeveer 17 minuten.
Bij het bepalen van de drempel, kunnen extra hoge frequentie stimuli worden geleverd aan de dezelfde vliegen (na de juiste tijd voor de refractaire periode) tot de drempel wordt bepaald of tot de gigantische vezel reactie te zwak om te zien.
Na het experiment is voltooid, wordt de vlieg uit de elektrofysiologie opgezet, bevrijd van de was, en afgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze video heeft aangetoond dat de basisstappen in het bepalen van de drempel voor epileptische aanvallen van een individu Drosophila vliegen. In plaats van het gebruik van de digitale oscilloscoop, kan een computer digitizer ook worden gebruikt. Deze techniek is handig voor het bepalen van de effecten van een geneesmiddel of genetische verandering op de drempel voor epileptische aanvallen van een vlieg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een NIH onderzoek te verlenen, een Epilepsy Foundation subsidie en een McKnight Foundation te verlenen aan MT Experimenten op Drosophila fruitvliegjes werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de UC Berkeley dierproeven comite.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital oscilloscope | Hitachi | VC-6523 | |
| Stimulator | Cornerstone | S-900 | |
| Preamplifier | World Precision Instruments, Inc. | Electro 705 | |
| Micromanipulators | Narishige International | various |
References
- Kuebler, D., Tanouye, M. A.
- Kuebler, D., Zhang, H., Ren, X., Tanouye, M. A. Genetic suppression of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 86, 1211-1225 (2001).
- Song, J., Tanouye, M. A. Seizure suppression by shakB2, a gap junction mutation in Drosophila. J Neurophysiol. 95, 627-635 (2006).
