Summary
本文介绍了高时空分辨率技术的光学图像行动的Langendorff灌注大鼠的心，用一个电位染料（DI - 8 - ANEPPS）表面上的潜在流动。
Abstract
电压敏感的荧光染料的心脏表面的光的映射已成为一个重要的工具，以调查在实验模型电励磁，在量程范围从细胞培养到整个器官
Protocol
第1部分：准备的解决方案和离体心脏系统
- 在上午的实验中，4.0 L是克雷布斯- Henseleit溶液准备如前所述[5，6] 。
- 11 mmol / L的2,3 - 丁二酮肟（BDM），溶解在1.0步骤1.1准备灌流转自克雷布斯Henseleit解决方案的大号。
- 从在步骤1.1准备灌流克雷布斯- Henseleit一个额外的150毫升和5 mol / L的DI - 8 - ANEPPS（10毫摩尔/升，溶解在二甲基亚砜（DMSO）的股票稀释）混合。
- 这3个方案被转移到水套式玻璃水库（Radnoti）是预先加热至41.0 ° C，并与淹没起泡使用0.2微米的过滤95％O 2（Radnoti）含氧; 5％的CO 2气体。 3股票水库的解决方案MASTERFLEX™L / S蠕动泵和低吸收硅胶管（科尔 - 帕默）输送壁挂式的Langendorff系统。
- 大会之前的Langendorff系统玻璃器皿（Radnoti）认真洗净，用E - TOXA清洗试剂（Sigma - Aldrich公司）和0.1 M / L盐酸，100％的乙醇，蒸馏水彻底冲洗。
- 非循环的Langendorff仪器被修建提供70毫米汞柱，从3个独立的含氧的水库，这是发自内心的分离与水套式加热线圈和泡沫陷阱的恒压（Radnoti）[ 7]。 3个独立的灌注线衔接上述两个3活塞的心，使我们能够精确地控制在1.1至1.3的步骤准备的解决方案交付。水套玻璃器皿MASTERFLEX PharMed BPT油管（科尔 - 帕默）系列连接，并加热到39 ° C的蒸馏水，采用两个环形（劳达）E100。通过铂固化硅胶管（科尔 - 帕默）连接压头水库的加热线圈和泡沫陷阱热损失在37 ° C灌流到达心脏。
第2部分：收获的大鼠心脏和设置Langendorff灌流
- 深全身麻醉，诱导Lewis大鼠200-250克，100毫克/公斤氯胺酮及10毫克/公斤甲苯噻嗪注射到腹腔内。这种混合物中，我们添加500 U /公斤肝素，以防止在explantation过程中的凝血功能和心肌缺血。
- 为了便于访问的心脏及大血管，前胸壁被删除。之后，周围组织仔细解剖，打开心包的麻袋。
- 以下的下腔静脉的鉴定，此船是用5-0丝线（爱惜康）和整个心肺块explanted结扎。组织立即放置在冰冷的克雷布斯- Henseleit一个50 mL烧杯中，在冰中的解决方案。
- 迅速查明升主动脉和周围组织的解剖。一个大小合适的套管（哈佛器械）被插入到主动脉，照顾，以避免中断通过插入到主动脉根部太远插管灌注冠状动脉的义务。 5-0丝线（爱惜康）升主动脉插管是安全。
- 大鼠心脏的Langendorff仪器，然后放置在没有引入气泡套管。逆行冠状血管灌注的温暖，含氧克雷布斯Henseleit步骤1.6中所描述的压力头解决方案现已确定。
- 现在删除额外的组织，包括肺，心灌流20分钟，以允许功能的恢复和稳定的节奏。在这段时间内，一个非常薄的热电偶温度探头（科尔 - 帕默）引入左心室腔，并在5-0普理灵缝合（爱惜康）缝合。在探头连接到热控制器（从DIGI - SENSE），以确保心脏的温度保持在37 °调整水循环泵的设置，从心尖灌流淋漓的运动是最大限度地降低污水中的插座放置一块纱布。
第3部分：心脏负荷电位染料和收购电图及光信号
- DI - 8 - ANEPPS（Invitrogen）的加载切换到含有荧光染料使用活塞克雷布斯Henseleit混合灌注线入心。此外，18G套管的左侧和/或右心房和额外的50毫升的染料溶液放入，慢慢进入每个商会管理，因为他们没有足够的灌注通过冠状动脉介绍染料。
- 在装载过程中，3心电图导联（哈佛器械），轻轻地放在心，面对的不是用于映射的光学表面。电极定位后左心室心尖部分，N O 2的左心房上，和N N O 1
- 心电图放大器（雨果萨克斯Elektronik公司）设置：高通滤波器：0.1赫兹
低通滤波器：150赫兹 - CMOS摄像头（RedShirt成像）和macroscope使用XYZ的调整定位，使心脏表面的重点和中心在收购框架。摄像机和光学系统安装在振动隔离表（减号k技术），以尽量减少共振频率。同时，同轴的起搏电极（哈佛器械）控制的一个孤立的，S48电刺激装置（草），是摆在右心房和心脏的节奏在每分钟300次（图1）。
- 电刺激（草）的设置：
速率：每秒5脉冲
延迟：0.2毫秒
时间：2毫秒
电压：6-12 V
模式：重复
脉冲：单 - 对于缺乏收缩运动伪影的光学录音，心脏需要机电耦合。为此，我们再次切换灌注线克雷布斯Henseleit解决方案，其中包含11毫摩尔/大号的BDM。采集之间，心是十足的克雷布斯- Henseleit灌注，以帮助维护编制的可行性。
- 记录参数设置，使用下面的收购设置软件（RedShirt影像）：
配置：2000赫兹; 128x128像素阵列
帧间隔：0.5毫秒
相机放大器增益：5倍
片上增益：8X - 12Me井
快门速度：500毫秒延迟
张数：4000
时间：2000毫秒 - 所有会议室和设备的灯都关闭或屏蔽，以消除在录制过程中的背景噪音。 LED灯亮起，仅在光学记录的心，以减少光漂白和染料的毒性。通过控制面板提供一个D -在电脑板（RedShirt成像）的方式与一个5 V脉冲光源的快门是控制。
第4部分：使用RedShirt图像处理软件，分析采集信息
- 采集，数据处理使用不同的过滤器设置。除了调整时，乐队停止/通滤波器，这是遗留的边界在44.0和98.0正确的边界设置，我们一般使用默认设置。随后记录的信息处理和生成（RedShirt影像）的影片。
- 从一个采集数据对应的地方在心脏表面上的16384站点超过2秒内的电激活。该软件允许直接与彼此之间以及与心房和心室电图的录音相比，这些地方的信号。数据，然后通过当地的电气激活映射的颜色和渲染动画显示的时空心脏表面上的电激活信息可视化。要创造这样一个动画，我们使用的软件：
- 时间上和/或空间的数据进行筛选
- 选择一个动画的开始和结束时间
- 地图颜色的基础上休息的每个像素的光线强度的光信号
- 心的图片叠加产生的颜色数据
- 生成动画
第5部分：代表结果
如果灌注心脏准备在录制过程中一动不动，光信号显示DI - 8 - ANEPPS排放强度的变化所涉及的每一个像素点不同的高峰之一。 （图3和4）相应的电影表现出一个激励整个的心，以及同时收购（图2）电图录音外膜表面传播的波前。
图1。一个的Langendorff灌注心脏准备的照片描绘右心房起搏电极的位置和心电图导致在步骤3.2中所述。
图2代表的光信号从一个刘易斯灌流大鼠心脏电图的录音。 A显示了一个用于光学成像的心外膜表面的形象。选择显示在荧光发射在B组随时间的变化像素的位置，是由彩色箭头表示。电图信号显示在C组，表明心房激活和心室信号对应的淡蓝色线与红色线。请ve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg“>点击这里看的这个数字大的版本。
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Discussion
麻醉大鼠的心去除，必须快速进行，以避免心肌缺血。如果发生缺血或冠状动脉灌注不足，心脏可能会发展性心律失常，并可能成为心肌梗死。此外，这些心会显示信息录音和后续分析的荧光发射不足。加载染料之前，需要充分克雷布斯- Henseleit溶液灌注心肌细胞，建立和保持一个稳定的电脉冲的生理电解质的环境。准确的灌流准备也是必要的，以保持适当的的器官的活力和功能。电解质浓度或灌流不足过滤的差异可能会导致致命的心肌功能不全和心律紊乱。为光学录音，心必须完全加载电压敏感染料。这是心房，尤其是重要的，这些商会由冠状动脉灌注。我们已经发现，额外的内部空洞的心房灌流将建立一个良好的光信号。此外，收购最优质的电压追查，需要灌注心脏，一动不动;否则，荧光的变化不能可靠地用于跟踪高保真信号漂移造成的工件的膜电位的变化。这将导致一个像素，而不是单峰多峰。其他的方法来消除运动伪影，光录音包括机械固定，治疗与其他兴奋收缩uncouplers（如细胞松弛素D，blebbistatin），信号处理，并通过数学建模[1，8] 。最后，这里介绍的方法只是提供有关行动潜能运动对心脏外膜表面。替代的组织筹备工作和红外电位染料可能解决在其他地区的心脏电气的传播特性。
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Disclosures
机构动物护理和使用委员会在波士顿儿童医院的规定的准则和法规的规定进行了动物实验。
Acknowledgments
这项工作是从美国国立卫生研究院的研究补助金（HL068915 HL088206）和在波士顿儿童医院的心脏传导基金捐款支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen | D-3167 |
References
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- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
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