离体灌注大鼠心脏的光学标测

摘要

本文介绍了一种高时间和空间分辨率的技术，利用电位敏感染料（di-8-ANEPPS）对离体灌注的大鼠心脏表面动作电位的传播进行光学成像。

摘要

使用电压敏感性荧光染料对心脏表面进行光学标测，已成为研究从细胞培养到完整器官等不同尺度实验模型中电兴奋活动的重要工具^{[1, 2]}. 利用先进的光学成像系统，几乎可以实时可视化正常心律期间或心律失常发生与维持过程中动作电位的产生与传播^[1]. 最新上市的商用系统能够提供极高的时空分辨率信息，这些系统最初是基于自行构建的设备开发的，旨在克服传统电生理学方法所带来的局限性^[1]. 高分辨率和高速互补金属氧化物半导体（CMOS）相机、高亮度发光二极管（LED）、电压敏感染料、光学元件及滤光片的不断进步，已使电生理信号的采集对更习惯使用显微镜的心血管细胞生物学家而言变得切实可行。尽管最新一代的CMOS相机可在16,384像素阵列上实现每秒10,000帧的采集速度，但根据样本制备类型的不同，已广泛应用的荧光信号采集技术（如光电二极管阵列、激光扫描系统和冷却电荷耦合器件（CCD）相机）在动态范围、信噪比和量子效率方面仍具有一些明显优势。^{[1, 3]}. 在本研究中，大鼠心脏被灌注ex vivo使用改良的Langendorff装置，以37°C的晶体灌注液（Krebs-Henseleit溶液）进行灌注。经过20分钟的稳定期后，心脏间歇性地灌注11 mmol/L的2,3-丁二酮单肟，以消除图像采集期间与收缩相关的心肌运动。对于光学标测，我们用心肌细胞膜电位快速响应探针di-8-ANEPPS对心脏进行负载。^[4] （5 μMol/L）并用475±15 nm激发光短暂照射样本。在典型的2秒照射期间， >使用连接至水平体视显微镜的高速CMOS相机采集离体心脏标本发出的605 nm光信号。在本演示中，通过连接至独立电刺激仪的同轴电极以300次/分钟的频率起搏心脏。同步获取双极心电图记录，并与电压信号一起使用常规软件进行分析。通过该方法，可对Langendorff灌注大鼠心脏表面的动作电位进行可视化观察，并与心电图信号同步记录。

方案

第1部分：配制溶液及准备离体灌流心脏系统

1. 实验当天早晨，按先前所述方法配制 4.0 L 的 Krebs-Henseleit 溶液^{[5, 6]}。
2. 将 11 mMol/L 的 2,3-丁二酮单肟（BDM）溶解于步骤 1.1 中配制的灌流液分装出的 1.0 L Krebs-Henseleit 溶液中。
3. 从步骤 1.1 配制的灌流液中另取出 150 mL，与 5 Mol/L 的 di-8-ANEPPS（用二甲基亚砜（DMSO）稀释自 10 mMol/L 储存液）混合。
4. 将上述三种溶液转移至带水套的玻璃储液瓶（Radnoti）中，预热至 41.0°C，并使用浸入式鼓泡器（Radnoti）以经 0.2 μm 滤膜过滤的 95% O₂ 和 5% CO₂ 混合气体进行氧合。三种储备液通过 MasterFlex™ L/S 蠕动泵和低吸附性硅胶管（Cole-Parmer）输送至壁挂式 Langendorff 系统。
5. 在组装前，Langendorff 系统的玻璃器皿（Radnoti）需用 E-TOXA-CLEAN 试剂（Sigma-Aldrich）仔细清洗，并依次用 0.1 M/L HCl、100% 乙醇和蒸馏水充分冲洗。
6. 该非循环 Langendorff 装置设计为从三个独立的氧合储液瓶提供 70 mm Hg 的恒定压力，储液瓶与心脏之间设有带水套的加热线圈和气泡捕获装置（R....

讨论

从麻醉大鼠体内取出心脏必须迅速进行，以避免心肌缺血。如果发生缺血或冠状动脉灌注不足，心脏很可能出现心律失常，并可能发生梗死。此外，这些心脏将表现出荧光发射不足，无法获得可用于有效记录和后续分析的数据。在加载染料之前，必须用心肌细胞充分灌注Krebs-Henseleit溶液，以建立并维持生理电解质环境，从而保证电冲动的稳定性。准确配制灌流液对于维持器官的正常存活性和功能也十分必要。灌流液中电解质浓度的差异或过滤不充分，均可能导致致命的心肌功能障碍和心律失常。对于光学记录，心脏必须完全负载电压敏感性染料。这一点对于心房心肌尤为重要，因为这些腔室的冠状动脉灌注较差。我们发现，对心房进行额外的腔内灌注可获得良好的光学信号。此外，要获取高质量的电压追踪信号，灌流心脏必须保持静止；否则，由于信号漂移引起的人工伪影，荧光发射的变化将无法可靠地高保真反映膜电位的变化，这会导致单个像素出现多个峰，而非单一峰。其他消除光学记录中运动伪影的方法包括机械固定、使用其他兴奋-收缩解偶联剂（如细胞松弛素D、blebbistatin）、信号处理以及数学建模^{[1, 8]}。最后，本文所述方法仅提供有关动作电位在心脏心外膜表面传导的信息。其他组织制备.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CardioCMOS-SM128f	设备	RedShirtImaging, LLC
CardioPlex 软件	设备	RedShirtImaging, LLC
LUXEON LED 光源 460-490 nm	设备	Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA	LXHL-PB02
ECG 放大器 Type 689 Hugo Sachs Elektronik	设备	哈佛仪器公司	730149
505 nm 二向色镜	设备	Semrock	FF505-SDi01-25x36
605 nm 长通发射滤光片	设备	SciMedia
THT 侧向支架	设备	SciMedia	25 BM-8
微型球形关节支架	设备	哈佛仪器公司	BS4 73-0177
小型刺激电极组	设备	哈佛仪器公司	BS4 73-0160
BM-6 台式振动隔离平台	设备	Technology Inc., Inglewood, CA 90301	25 BM-6
单极 ECG 电极	设备	哈佛仪器公司	BS4 73-0200
滚轮泵 SCI 400	设备	Watson-Marlow 泵业集团	401U/D1
滚轮泵 MasterFlex Easy Load II	设备	Cole-Parmer	型号 77201-60
Marprene #14 管路	设备	Watson-Marlow 泵业集团	902.0016.016
MasterFlex 管路	设备	PharMed, Westlake, OH 44145 USA	06485-25
S48 方波脉冲刺激器	设备	Grass Technologies	型号 S48
SIU5 射频变压器隔离单元	设备	Grass Technologies	型号 SIU5
5 升水套式储液槽	设备	Radnoti Glass Technology Inc.	120142-5
2 升水套式储液槽	设备	Radnoti Glass Technology Inc.	120142-2
0.5 升水套式储液槽	设备	Radnoti Glass Technology Inc.	120142-0
0.25 升水套式储液槽	设备	Radnoti Glass Technology Inc.	120142-025
10 ml 加热盘管	设备	Radnoti Glass Technology Inc.	158822
顺应性气泡捕获器	设备	Radnoti Glass Technology Inc.	130149
Luer 断开式套管	设备	哈佛仪器公司	72-1444
三通止流阀，FLL 转 MLT，无端口盖	设备	哈佛仪器公司	BS4 72-2630
热电偶温度计	设备	Cole-Parmer	WU-91100-40
Ultra Fine IT 系列柔性微探针	设备	PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA	IT-24P
示波器 Tektronix TDS 1002	设备	Tektronix, Inc.	TDS 1002B
2,3-丁二酮单肟	试剂	Sigma-Aldrich	B0753
盐酸氯胺酮	试剂	Hospira Inc.	RL-0065
赛拉嗪	试剂	Lloyd, Inc.	LB15705A
E-TOXA-CLEAN®	试剂	Sigma-Aldrich	E9029
Di-8-ANEPPS	试剂	Invitrogen	D-3167