Summary
Este artigo descreve uma técnica de alta resolução temporal e espacial, visualmente, movimento de ação potencial imagem sobre a superfície de corações de ratos perfundidos Langendorff-utilizando um corante potenciométrica (di-8-ANEPPS).
Abstract
Mapeamento óptico da superfície cardíaca com sensíveis à voltagem corantes fluorescentes tornou-se uma ferramenta importante para investigar excitação elétrica em modelos experimentais que variam em escala de culturas de células de todo o órgãos
Protocol
Parte 1: Prepare soluções eo sistema de coração isolado perfundido
- Na manhã do experimento, 4,0 L de Krebs-Henseleit está preparado como descrito anteriormente [5, 6].
- 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime (BDM) é dissolvido em 1,0 L de Krebs-Henseleit decantado do perfusato preparada no passo 1.1.
- Um adicional de 150 mL de Krebs-Henseleit é removido do perfusato preparada no passo 1.1 e misturado com 5 Mol / L di-8-ANEPPS (diluído a partir de um estoque 10 mMol / L dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO)).
- Estas três soluções são transferidos para com camisa de água de vidro reservatórios (Radnoti), onde são pré-aquecido a 41,0 ° C e oxigenada com um borbulhador submersa (Radnoti) com 0,2 m filtrada 95% O 2, 5% do gás CO 2. Soluções a partir de 3 reservatórios de ações são bombeados para o sistema de Langendorff parede com Masterflex ™ L / S bombas peristálticas e de baixa absorção de tubo de silicone (Cole-Parmer).
- Antes da montagem, o sistema de Langendorff vidro (Radnoti) é meticulosamente lavados com E-Toxa-CLEAN reagente (Sigma-Aldrich) e bem enxaguadas com 0,1 M / L HCl, 100% de etanol, e água destilada.
- O não-recirculação Langendorff aparelho foi construído para entregar 70 mm Hg a pressão constante de 3 reservatórios separados oxigenados, que são separados a partir do coração com bobinas de jaqueta de água de aquecimento e armadilhas bolha (Radnoti) [7]. As 3 linhas de perfusão independente convergem acima do coração, duas torneiras de 3 vias, permitindo-nos controlar com precisão a entrega das soluções preparadas em passos 1,1-1,3. Jaqueta de água de vidro é ligado em série com Masterflex tubulação BPT Pharmed (Cole-Parmer) e aquecida a 39 ° C com água destilada usando dois circuladores E100 (Lauda). Perda de calor através do tubo de silicone de platina curado (Cole-Parmer) que conecta os reservatórios de pressão de cabeça para as bobinas de aquecimento e armadilhas bolha resultou em um 37 ° C perfusato atingindo o coração.
Parte 2: Colheita do coração de rato e set-up de perfusão Langendorff
- Para induzir a anestesia geral profunda em ratos Lewis 200-250 g, 100 mg cetamina / kg e 10 Xilazina mg / kg é injetado na cavidade intraperitoneal. Para esta mistura, acrescentamos 500 Heparina U / kg para evitar a coagulação do sangue e isquemia miocárdica durante o procedimento de remoção.
- Para fácil acesso ao coração e grandes vasos, parede anterior do tórax é removido. Depois disso, o tecido circundante é cuidadosamente dissecados e do saco pericárdico aberto.
- Após a identificação da veia cava inferior, esta embarcação é ligada com seda 5-0 (Ethicon) eo bloco coração-pulmão inteiro é explantado. Tecido é colocado imediatamente em solução gelada Krebs-Henseleit contida em um copo de 50 mL no gelo.
- A aorta ascendente é rapidamente identificado e dissecado do tecido circundante. Uma cânula de tamanho apropriado (Harvard Apparatus) é inserido na aorta, tendo o cuidado de evitar a interrupção da perfusão obrigatória das artérias coronárias através da inserção da cânula muito longe na raiz da aorta. A cânula é fixada à aorta ascendente com seda 5-0 (Ethicon).
- O coração de rato é então colocada sobre o aparelho Langendorff sem a introdução de bolhas de ar na cânula. Perfusão coronária retrógrada vascular é agora estabelecida com a quente, oxigenada solução de Krebs-Henseleit a partir da pressão de cabeça descrito no passo 1.6.
- Tecido extra, incluindo os pulmões, é removido eo coração é perfundidos por 20 minutos para permitir a recuperação da função e estabilizar o ritmo. Durante este tempo, uma sonda de temperatura muito fino termopar (Cole-Parmer) é introduzido na cavidade do ventrículo esquerdo e suturado no lugar com Prolene 5-0 sutura (Ethicon). A sonda é ligada a um termo-controlador (Digi-Sense) para garantir a temperatura do coração é mantida a 37 ° C, ajustando as configurações das bombas de circulação de água. Movimento de perfusato pingando do ápice cardíaco é minimizado pela colocação de um pedaço de gaze no receptáculo de efluentes.
Parte 3: coração de carga com corante potenciométrica e adquirir sinais eletrográficos e óptica
- Di-8-ANEPPS (Invitrogen) é carregado para o coração, alternando para a linha de perfusão que contém a mistura de Krebs-Henseleit com o corante fluorescente usando uma torneira. Além disso, uma cânula de 18G é colocado no átrio esquerdo e / ou para a direita e de 50 mL de solução corante adicional é administrado lentamente em cada uma destas câmaras, porque eles não são suficientemente perfundidos com corante introduzido através das artérias coronárias.
- Durante o procedimento de carga, três derivações (Harvard Apparatus) são delicadamente colocados sobre a superfície do coração que não está enfrentando a ótica utilizada para o mapeamento. Eletrodo N o 1 está posicionado na parte posterior apical do ventrículo esquerdo, o N 2 no átrio esquerdo, e N
- ECG amplificador (Hugo Sachs Elektronik) configurações: filtro passa-alto: 0,1 Hz
Filtro passa-baixa: 150 Hz - A câmera CMOS (redshirt Imaging) e macroscópio é posicionado usando os ajustes XYZ modo que a superfície do coração está em foco e centrado no quadro de aquisição. A câmara óptica e são montados em uma mesa de isolamento de vibração (Minus K Technology) para minimizar as freqüências de ressonância. Ao mesmo tempo, um eletrodo de marcapasso coaxial (Harvard Apparatus) controlada com um isolado, S48 unidade de estimulação elétrica (Grass), é colocado no átrio direito eo coração está acelerado a 300 batimentos por minuto (Figura 1).
- Estimulação elétrica (Grass) configurações:
Taxa: 5 pulsos por segundo
Delay: 0,2 ms
Duração: 2 ms
Volts: 6-12 V
Modo: Repetir
Pulso: Single - Para gravações óptico que falta artefatos de movimento de contração, o coração precisa ser desacoplado eletromecânica. Fazemos isso de novo comutação de linhas de perfusão de Krebs-Henseleit solução que contém 11 mmol / L BDM. Entre as aquisições, o coração é puro perfundidos com Krebs-Henseleit para ajudar a preservar a viabilidade da preparação.
- Os parâmetros de gravação são definidos usando o software (Imaging redshirt) com as configurações de aquisição seguintes:
Configuração: 2.000 Hz; 128x128 matriz de pixels
Intervalo de quadro: 0,5 ms
Ganho câmera Amplificador: 5x
On-Chip Gain: 8x-12Me bem-
Obturador: 500 ms de atraso
Número de Frames: 4000
Duração: 2000 ms - Todas as luzes da sala e equipamentos estão desligados ou blindado para eliminar o ruído de fundo durante a gravação. A luz LED ilumina o coração só durante a gravação óptica para reduzir a foto-branqueamento e toxicidade de corantes. O obturador fonte de luz é controlada com um pulso de 5 V entregue através do painel de controle por meio de uma D-to-Uma placa no computador (Imaging redshirt).
Parte 4: Analisar as informações de aquisição utilizando Software Imaging redshirt
- Após a aquisição, os dados são processados utilizando-se diferentes configurações do filtro. Em geral, usar as configurações padrão, exceto quando se ajusta a Banda Stop / Passe filtro, que é definido com o limite à esquerda em 44,0 e no limite direito a 98,0. Depois as informações gravadas são processados e um filme é gerado (Imaging redshirt).
- Dados de uma aquisição corresponde à ativação local elétrica em 16.384 sites na superfície do coração durante um período de 2 segundos. O software permite que estes sinais locais para ser diretamente comparados entre si e com as gravações atriais e ventriculares eletrográfico. Dados são então visualizados através do mapeamento de ativação elétrica local a cor e tornando esta informação como uma animação mostrando a ativação espaço-temporal elétrica na superfície cardíaca. Para criar tal uma animação, usamos o software para:
- temporal e / ou filtrar os dados espacialmente
- selecionar um tempo de início e término para a animação
- sinais ópticos para mapa de cores com base na intensidade da luz de descanso de cada pixel
- sobrepor os dados de cor resultante com uma imagem do coração
- gerar a animação
Parte 5: Os resultados representativos
Se a preparação do coração perfundido estava imóvel durante a gravação, o sinais ópticos mostram um pico distinto para cada pixel envolvido em uma mudança da intensidade de emissão de di-8-ANEPPS. Os filmes correspondentes (Figuras 3 e 4) demonstram uma frente de onda de excitação propagação em toda a superfície epicárdica do coração, assim como as gravações simultaneamente adquiridas eletrocardiográfico (Figura 2).
Figura 1. Uma fotografia de uma preparação de coração Langendorff-perfundidos representando as posições do eletrodo de marcapasso em átrio direito e do ECG, como descrito no passo 3.2.
Figura 2. Representante sinais ópticos e gravações eletrocardiográfico de um coração de rato perfundido Lewis. Um painel mostra uma imagem da superfície epicárdica utilizado para geração de imagens ópticas. A posição dos pixels selecionados para demonstrar as mudanças na emissão de fluorescência ao longo do tempo no Painel B são indicadas por setas coloridas. Sinais eletrográficos são mostrados no painel C com a linha vermelha que indica a ativação atrial ea linha de luz azul correspondente ao sinal ventricular. Por favorve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "> clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
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Discussion
Remoção do coração de ratos anestesiados deve ser realizada rapidamente para evitar a isquemia miocárdica. Se isquemia ou insuficiente perfusão coronária ocorre, o coração provavelmente irá desenvolver arritmias e pode tornar-se infartado. Além disso, esses corações irá mostrar emissão de fluorescência insuficiente para gravações informativo e análises subseqüentes. Antes de colocar o corante, as células do miocárdio têm de ser adequadamente perfundidos com Krebs-Henseleit para estabelecer e manter um ambiente eletrolítico fisiológico para a estabilidade de impulsos elétricos. Preparação precisa do perfusato é também necessário para manter a viabilidade do órgão ea função. Diferenças na concentração de eletrólitos ou filtragem insuficiente do perfusato provavelmente levará a disfunção miocárdica fatal e distúrbios do ritmo cardíaco. Para as gravações ópticas, o coração deve ser completamente carregado com sensíveis à voltagem corante. Isto é especialmente importante para o miocárdio atrial como estas câmaras não são bem perfundidos por artérias coronárias. Nós descobrimos que a perfusão intra-cavitárias adicionais dos átrios vai estabelecer um bom sinal óptico. Além disso, a aquisição dos traçados de alta qualidade tensão exige o coração perfundido de ser imóvel, caso contrário, as mudanças na emissão de fluorescência não pode ser confiavelmente utilizado para controlar as alterações no potencial de membrana com alta fidelidade, devido a artefatos causados por desvio de sinal. Isto irá resultar em picos múltiplos para um pixel ao invés de um único pico. Outros métodos para eliminar artefatos de movimento a partir de gravações ópticas incluem imobilização mecânica, tratamento com outros excitação-contração desacopladores (por exemplo, citocalasina D, blebbistatin), processamento de sinal, e por modelagem matemática [1, 8]. Finalmente, o método aqui descrito fornece apenas informações sobre o movimento do potencial de ação na superfície epicárdica cardíaca. Preparações de tecidos alternativos e infravermelho corantes potenciométrica pode resolver as características de propagação elétrica em outras regiões do coração.
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Disclosures
Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Institutional Animal Care e do Comitê Use do Hospital Infantil de Boston.
Acknowledgments
Este trabalho é suportado por verbas de pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde (HL068915; HL088206) e contribuições para o Fundo de Condução Cardíaca do Hospital Infantil de Boston.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen | D-3167 |
References
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- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
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- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
