Summary
Questo articolo descrive una tecnica ad alta risoluzione temporale e spaziale a otticamente movimento immagine del potenziale d'azione sulla superficie del Langendorff-cuore perfuso di ratto utilizzando un colorante potenziometrica (di-8-ANEPPS).
Abstract
Mappatura ottica della superficie cardiaca con coloranti fluorescenti voltaggio-sensibile è diventato un importante strumento per indagare l'eccitazione elettrica in modelli sperimentali che vanno in scala da colture di cellule di interi organi
Protocol
Parte 1: Preparare le soluzioni e il sistema isolato cuore perfuso
- La mattina del dell'esperimento, 4,0 L di Krebs-Henseleit soluzione viene preparata come descritto in precedenza [5, 6].
- 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime (BDM) è sciolto in 1,0 L di Krebs-Henseleit soluzione decantata dal perfusato preparato al punto 1.1.
- Altri 150 ml di Krebs-Henseleit viene rimosso dal perfusato preparato al passo 1.1 e mescolato con 5 mol / l di-8-ANEPPS (diluito da un mMol / L 10 magazzino sciolto in dimetilsolfossido (DMSO)).
- Queste tre soluzioni sono trasferiti ad acqua con camicia in vetro serbatoi (Radnóti) dove sono pre-riscaldato a 41,0 ° C e ossigenata con un gorgogliatore sommerso (Radnóti) con 0,2 micron filtrata 95% O 2, 5% CO 2. Le soluzioni da 3 serbatoi magazzino vengono pompati al muro con sistema Langendorff Masterflex ™ L / S pompe peristaltiche ea basso assorbimento tubo al silicone (Cole-Parmer).
- Prima del montaggio, il sistema Langendorff vetro (Radnóti) è meticolosamente lavata con E-Toxa-CLEAN reagente (Sigma-Aldrich) e risciacquata a fondo con 0,1 M / L HCl, 100% di etanolo e acqua distillata.
- Il mancato ricircolo Langendorff apparato è stato costruito per fornire 70 mm Hg a pressione costante da 3 serbatoi separati ossigenati, che sono separati dal cuore con l'acqua con camicia serpentine di riscaldamento e trappole bolla (Radnóti) [7]. Le 3 linee di perfusione indipendente convergono sopra il cuore a due rubinetti a 3 vie, che ci permette di controllare con precisione la consegna delle soluzioni preparate in passi 1,1-1,3. Acqua con camicia vetro è collegato in serie con tubi BPT Masterflex PharMed (Cole-Parmer) e riscaldato a 39 ° C con acqua distillata usando due circolatori E100 (Lauda). Perdita di calore attraverso il platino tubo al silicone vulcanizzato (Cole-Parmer) che collega la pressione di testa serbatoi per le bobine di riscaldamento e trappole bolla portato ad una temperatura di 37 ° C perfusato raggiungere il cuore.
Parte 2: Raccolta del cuore di ratto e set-up perfusione Langendorff
- Per indurre profonda anestesia generale in 200-250 g ratti Lewis, 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xylazina viene iniettato nella cavità intraperitoneale. A questa miscela, si aggiungono 500 U / kg di eparina per prevenire la coagulazione del sangue e l'ischemia miocardica durante la procedura di espianto.
- Per un facile accesso al cuore e dei grossi vasi, la parete toracica anteriore è stato rimosso. Dopo di che, il tessuto circostante è attentamente sezionato e aperto il sacco pericardico.
- A seguito di identificazione della vena cava inferiore, il vaso è legatura con 5-0 seta (Ethicon) e l'intero blocco cuore-polmone è espiantati. Tessuti è immediatamente posto in ghiacciata Krebs-Henseleit soluzione contenuta in un bicchiere da 50 ml su ghiaccio.
- L'aorta ascendente è rapidamente individuato e sezionato dal tessuto circostante. Una di dimensioni idonee cannula (Harvard Apparatus) è inserita nell'aorta, avendo cura di evitare di interrompere la perfusione obbligatorio delle arterie coronarie mediante l'inserimento della cannula troppo nella radice aortica. La cannula viene fissato l'aorta ascendente con 5-0 seta (Ethicon).
- Il cuore di ratto è poi situato su di esso Langendorff senza introdurre bolle d'aria nella cannula. Retrograda perfusione vascolare coronarica è ormai consolidata con il caldo, ossigenata di Krebs-Henseleit soluzione dalla pressione a testa descritto al punto 1.6.
- Tessuto extra, tra cui i polmoni, è ora rimosso e il cuore è perfuso per 20 minuti per permettere il recupero della funzione e stabilizzare il ritmo. Durante questo periodo, una sonda molto sottile di temperatura termocoppia (Cole-Parmer) è introdotto nella cavità ventricolare sinistra e suturato in posizione con 5-0 Prolene sutura (Ethicon). La sonda è collegata ad un termo-regolatore (di Digi-Sense) per garantire la temperatura del cuore è mantenuta a 37 ° C regolando le impostazioni di pompe di circolazione dell'acqua. Moto da perfusato stillicidio dalla apice cardiaco è ridotto al minimo mettendo un pezzo di garza nel recipiente effluenti.
Parte 3: il cuore di carico con colorante potenziometrica e acquisire segnali elettrografiche e ottici
- Di-8-ANEPPS (Invitrogen) viene caricato nel cuore passando alla linea di perfusione contenente il Krebs-Henseleit miscelato con il colorante fluorescente con un rubinetto. Inoltre, una cannula 18G è collocato nell'atrio sinistro e / o diritto e ulteriori 50 ml di soluzione colorante sta lentamente somministrato in ognuna di queste camere perché non sono sufficientemente perfusi con colorante introdotto attraverso le arterie coronariche.
- Durante la procedura di caricamento, 3 derivazioni ECG (Harvard Apparatus) sono gentilmente messo sulla superficie del cuore che non sta affrontando l'ottica utilizzata per la mappatura. Elettrodo N o 1 è posizionato sulla parte posteriore apicale del ventricolo sinistro, N ° 2 sul atrio sinistro, e N
- ECG amplificatore (Hugo Sachs Elektronik) impostazioni: filtro passa-alto: 0,1 Hz
Filtro passa basso: 150 Hz - La fotocamera CMOS (redshirt Imaging) e macroscopio stata posizionata mediante gli aggiustamenti XYZ modo che la superficie del cuore è a fuoco e centrata nella cornice di acquisizione. La fotocamera e le ottiche sono montate su un tavolo isolamento dalle vibrazioni (Minus K Technology) per ridurre al minimo le frequenze di risonanza. Allo stesso tempo, un elettrodo di stimolazione coassiale (Harvard Apparatus), controllato con un isolato, S48 elettrico-stimolazione unità (Grass), è posto sulla atrio destro e il cuore viene stimolato a 300 battiti al minuto (Figura 1).
- Stimolazione elettrica (Erba) impostazioni:
Vota: 5 impulsi al secondo
Ritardo: 0,2 ms
Durata: 2 ms
Volt: 6-12 V
Modalità: Ripetizione
Pulse: Singolo - Per le registrazioni ottiche che mancano di artefatti da movimento di contrazione, il cuore ha bisogno di essere elettromeccanicamente disaccoppiato. Facciamo questo nuovo passaggio linee di perfusione a Krebs-Henseleit soluzione che contiene 11 mmol / L BDM. Tra acquisizioni, il cuore è perfuso con puro Krebs-Henseleit per aiutare a preservare la vitalità del preparato.
- I parametri di registrazione sono impostati utilizzando il software (Imaging redshirt) con le impostazioni di acquisizione seguenti:
Configurazione: 2.000 Hz; 128x128 gamma di pixel
Intervallo di telaio: 0,5 ms
Fotocamera Guadagno Amplificatore: 5x
On-Chip Guadagno: 8x-12Me-bene
Shutter: 500 ms di ritardo
Numero di fotogrammi: 4000
Durata: 2000 ms - Tutte le luci della stanza e le attrezzature sono disattivati o schermati per eliminare rumori di fondo durante la registrazione. La luce a LED illumina il cuore solo durante la registrazione ottica per ridurre fotometabolismo e tossicità colorante. L'otturatore sorgente luminosa è controllata con un impulso di 5 V fornita attraverso il pannello di controllo per mezzo di un D-to-A bordo del computer (Imaging redshirt).
Parte 4: Analisi delle informazioni di acquisizione utilizzando Imaging Software redshirt
- A seguito dell'acquisizione, i dati vengono elaborati utilizzando diverse impostazioni del filtro. Noi di solito utilizzare le impostazioni predefinite, tranne quando si regola la Banda Stop / filtro passa, che è impostato con il confine a sinistra al 44,0 e il bordo destro a 98,0. In seguito le informazioni registrate vengono elaborate e un film è generato (Imaging redshirt).
- I dati di uno di acquisizione corrisponde alla attivazione elettriche locali a 16.384 siti sulla superficie del cuore per un periodo di 2 secondi. Il software permette a questi segnali locali per essere direttamente confrontati tra loro e con le registrazioni atriali e ventricolari elettrografiche. I dati vengono quindi visualizzati con la mappatura locali attivazione elettrica per colorare e rendere queste informazioni come un'animazione che mostra l'attivazione spazio-temporale elettrico sulla superficie cardiaca. Per creare un'animazione tale, si usa il software:
- temporalmente e / o spazialmente filtrare i dati
- selezionare un orario di inizio e di fine per l'animazione
- segnali ottici mappa di colori in base a riposo l'intensità luminosa di ogni pixel
- sovrapporre i dati di colore risultante con una foto del cuore
- generare l'animazione
Parte 5: risultati Rappresentante
Se la preparazione cuore perfuso era immobile durante la registrazione, i segnali ottici mostrano un picco distinto per ogni pixel coinvolti in un cambiamento della intensità di emissione di di-8-ANEPPS. I film corrispondente (figure 3 e 4) dimostrare un fronte d'onda di eccitazione di propagazione attraverso la superficie epicardica del cuore così come le registrazioni acquisite simultaneamente elettrografiche (Figura 2).
Figura 1. Una fotografia di un Langendorff-perfuso preparazione cuore raffiguranti le posizioni degli elettrodi sulla stimolazione atrio destro e il derivazioni come descritto al punto 3.2.
Figura 2. Rappresentante segnali ottici e registrazioni elettrografiche da un cuore perfuso di ratto Lewis. Un pannello mostra un'immagine della superficie epicardico utilizzato per l'imaging ottico. La posizione dei pixel selezionati per dimostrare i cambiamenti nella emissione di fluorescenza nel tempo, nel Pannello di B sono indicati da frecce colorate. Segnali elettrografici sono mostrati in Pannello di C con la linea rossa che indica l'attivazione atriale e la linea di luce blu che corrisponde al segnale ventricolare. Per favoreve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "> clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'asportazione del cuore di ratti anestetizzati deve essere eseguita rapidamente per evitare di ischemia miocardica. Se la perfusione ischemia coronarica o insufficiente si verifica, il cuore probabilmente sviluppare aritmie e può diventare infartuata. Inoltre, questi cuori si dimostrano insufficienti emissione di fluorescenza per le registrazioni informative e le analisi successive. Prima di caricare il colorante, le cellule del miocardio devono essere adeguatamente perfusi con soluzione Krebs-Henseleit di stabilire e mantenere un ambiente fisiologico elettrolita per la stabilità degli impulsi elettrici. Accurata preparazione del perfusato è anche necessario per mantenere la vitalità propria di organi e funzioni. Differenze nella concentrazione di elettroliti o di filtraggio insufficiente del perfusato porterà probabilmente ad una disfunzione fatale del miocardio e disturbi del ritmo cardiaco. Per le registrazioni ottica, il cuore deve essere completamente caricato con tensione sensibili colorante. Ciò è particolarmente importante per il miocardio atriale come queste camere non sono ben irrorati dalle arterie coronarie. Abbiamo scoperto che ulteriori intra-cavitaria perfusione degli atri istituirà un buon segnale ottico. Inoltre, l'acquisizione di alta qualità tracciati tensione richiede il cuore perfuso di essere immobile, altrimenti, cambiamenti di emissione di fluorescenza non può essere attendibilmente usato per tenere traccia delle modifiche del potenziale di membrana di alta fedeltà a causa di artefatti causati dalla deriva del segnale. Questo si tradurrà in picchi multipli per un pixel piuttosto che un unico picco. Altri metodi per eliminare gli artefatti da movimento registrazioni ottiche comprendono immobilizzazione meccanica, il trattamento con altri eccitazione-contrazione uncouplers (ad esempio citocalasina D, blebbistatin), elaborazione del segnale, e dalla modellazione matematica [1, 8]. Infine, il metodo qui descritto si limita a fornire informazioni sui movimenti del potenziale d'azione sulla superficie cardiaca epicardico. Preparazione dei tessuti alternativi e infrarossi coloranti potenziometrico può risolvere le caratteristiche di propagazione elettrica in altre regioni del cuore.
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Disclosures
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso in bambini Hospital di Boston.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto da borse di ricerca dal National Institutes of Health (HL068915; HL088206) e contributi al Fondo di conduzione cardiaca presso il Children Hospital di Boston.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen | D-3167 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G.
- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
