Summary
מאמר זה מתאר טכניקה גבוהה ברזולוציה של זמן ומרחב התנועה תמונה אופטית פעולה פוטנציאל על פני השטח של Langendorff-perfused הלבבות חולדה באמצעות צבע פוטנציומטרית (di-8-ANEPPS).
Abstract
מיפוי אופטי של פני הלב עם מתח רגיש צבעי ניאון הפך כלי חשוב לחקור עירור חשמלי במודלים ניסיוניים טווח בהיקף של תרביות תאים אל כל האיברים
Protocol
חלק 1: פתרונות הכן ואת מערכת מבודדת בלב perfused
- בבוקרו של הניסוי, L 4.0 פתרון קרבס-Henseleit מוכנה כפי שתואר לעיל [5, 6].
- 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime (^ נם) מומס L 1.0 פתרון קרבס-Henseleit יצק מן perfusate שהוכן בשלב 1.1.
- 150 מ"ל נוספים של קרבס-Henseleit יוסר perfusate שהוכן בשלב 1.1 מעורב עם 5 מול / L di-8-ANEPPS (בדילול ממלאי mmol / L 10 מומס sulfoxide דימתיל (DMSO)).
- 3 פתרונות אלה מועברים מים במקטורן זכוכית מאגרים (רדנוטי) שם הם מראש לחמם 41.0 ° C ו מחומצן עם bubbler שקוע (רדנוטי) באמצעות 0.2 מיקרומטר, מסונן 95% O 2; גז 5% CO 2. פתרונות מן 3 מאגרים מניות נשאבים למערכת Langendorff הקיר עם משאבות MasterFlex ™ L / S peristaltic נמוך קליטה סיליקון צינורות (קול, בן הזוג).
- לפני ההרכבה, המערכת Langendorff זכוכית (רדנוטי) נשטף בקפידה עם מגיב E-TOXA-CLEAN (סיגמא אולדריץ) ושטף ביסודיות עם 0.1 M / L HCl, אתנול 100%, מים מזוקקים.
- המנגנון הלא הסירקולציה המחודשת Langendorff נבנה כדי לספק 70 מ"מ כספית בלחץ מתמיד של 3 מאגרים נפרדים מחומצן, אשר מופרדים מן הלב עם מים במקטורן סלילי חימום מלכודות בועה (רדנוטי) [7]. 3 קווי טפטוף עצמאי להתכנס מעל ללב בשני 3-way והברזים למיניהם, מאפשר לנו לשלוט במדויק אספקה של פתרונות מוכנים בצעדים 1.1-1.3. מים במקטורן זכוכית מחובר בסדרה עם צינורות BPT MasterFlex PharMed (קול, בן הזוג) והתלהב 39 ° C עם מים מזוקקים באמצעות שני circulators E100 (Lauda). אובדן חום דרך צינור פלטינה ריפא סיליקון (קול, בן הזוג) שמחבר את הלחץ על ראש מאגרים סלילי חימום מלכודות הבועה הביאה 37 ° C perfusate להגיע את הלב.
חלק 2: קציר לב חולדה הגדרת זלוף Langendorff
- כדי להשרות הרדמה כללית עמוקה 200-250 גרם לואיס חולדות, 100 מ"ג / ק"ג קטמין ו - 10 מ"ג / ק"ג Xylazine מוזרק לתוך חלל intraperitoneal. לתערובת זו נוסיף 500 U / kg הפרין כדי למנוע קרישת דם, שריר הלב במהלך ההליך explantation.
- עבור גישה קלה לב וכלי גדול, קיר בית החזה הקדמי מוסר. אחרי זה, הרקמה שמסביב הוא גזור בקפידה את שק קרום הלב נפתח.
- בעקבות זיהוי נחות הווריד הנבוב, כלי זה הוא ligated עם משי 5-0 (Ethicon) ואת כל גוש לב ריאה הוא explanted. רקמות ממוקם מיד קר כקרח פתרון קרבס-Henseleit הכלול מבחנה 50 מ"ל על הקרח.
- אבי העורקים עולה מזוהה במהירות גזור מן הרקמה הסובבת. צינורית כראוי בגודל (הרווארד Apparatus) מוכנס לתוך אבי העורקים, טיפול כדי למנוע הפרעה זלוף חובה של העורקים הכליליים על ידי החדרת צינורית רחוק מדי לתוך שורש האאורטה. קנית היא מאובטחת האאורטה עולה עם משי 5-0 (Ethicon).
- הלב חולדה ממוקם אז ללא החדרת בועות אוויר לתוך צינורית על המנגנון Langendorff. מדרדר זלוף כלי הדם הכליליים מוקמת כעת עם פתרון חם, קרבס-Henseleit מחומצן מן הראש בלחץ המתוארת בשלב 1.6.
- רקמות נוספות, כולל את הריאות, מוסר כעת את הלב הוא perfused במשך 20 דקות כדי לאפשר התאוששות של תפקוד ולייצב את הקצב. במהלך תקופה זו, בדיקה דקה מאוד טמפרטורה תרמי (קול, בן הזוג) מוחדר לחלל החדר השמאלי ואת sutured במקום עם 5-0 Prolene תפר (Ethicon). החללית מחובר תרמו בקר (Digi-Sense) כדי להבטיח את הטמפרטורה של הלב נשמר על 37 מעלות צלזיוס על ידי התאמת ההגדרות של משאבות מים הדם. Motion מ perfusate נוטף מן הקודקוד לב ממוזער על ידי הנחת פיסת גזה במכל בשפכים.
חלק 3: לב טען עם צבע פוטנציומטרית ולרכוש electrographic אותות אופטיים
- Di-8-ANEPPS (Invitrogen) הוא נטען לתוך הלב ידי מעבר לקו זלוף המכיל את קרבס-Henseleit מעורבב עם צבע פלואורסצנטי באמצעות שסתום. בנוסף, צינורית 18G ממוקם אל המבואה שמאל ו / או זכות ו 50 מ"ל נוסף של פתרון לצבוע מנוהל לאט לתוך אחד החדרים האלה כי הם לא מספיק perfused עם צבע הציג דרך העורקים הכליליים.
- במהלך ההליך טוען, 3 מוביל א.ק.ג. (הרווארד Apparatus) מונחות בעדינות על פני השטח של הלב שאינו מול אופטיקה משמש המיפוי. אלקטרודה N o 1 ממוקם בחלק apical האחורי של החדר השמאלי, N o 2 על אטריום שמאל, ו-N
- א.ק.ג. מגבר (הוגו זאקס Elektronik) הגדרות: מסנן פס גבוה: 0.1 הרץ
Pass Filter נמוך: 150 הרץ - מצלמת CMOS (RedShirt Imaging) ו macroscope ממוקמת באמצעות התאמות XYZ כך את פני השטח של הלב בפוקוס מרוכז בתוך מסגרת הרכישה. המצלמה אופטיקה הם רכובים על השולחן רטט בידוד (מינוס K טכנולוגיה) כדי למזער את תדר תהודה. במקביל, אלקטרודה צעדה קואקסיאליים (הרווארד Apparatus) נשלט עם יחידה מבודדת, גירוי חשמלי-S48 (דשא), מושם על אטריום הנכון הלב בקצב של 300 פעימות לדקה (איור 1).
- חשמל (דשא) גירוי הגדרות:
דרג: 5 פעימות בשנייה
עיכוב: 0.2 ms
משך הפעילות: 2 ms
וולט: 6-12 V
מצב: חזור
דופק: רווק - עבור הקלטות אופטי אשר חוסר ההצעה artifacts מהתכווצות הלב צריכה להיות זוגיים electromechanically. אנו עושים זאת באמצעות מיתוג מחדש קווי זלוף לפתרון קרבס-Henseleit המכיל 11 mmol / L ^ נם. בין הרכישות, הלב perfused עם טהור קרבס-Henseleit כדי לעזור לשמר את הכדאיות של התכשיר.
- הפרמטרים הקלטה נקבעים באמצעות התוכנה (הדמיה RedShirt) עם הגדרות הרכישה הבאה:
תצורה: 2,000 הרץ; 128x128 מערך פיקסל
מרווח פריים: 0.5 ms
מגבר רווח מצלמה: 5x
על שבב רווח: 8x-12Me-טוב
תריס: 500 עיכוב ms
מספר מסגרות: 4000
משך: 2000 ms - כל האורות בחדר וציוד מנוטרלים או מוגן לבטל רעשי רקע במהלך ההקלטה. הנורית מאירה את הלב רק במהלך ההקלטה אופטי כדי להפחית צילום הלבנת ורעילות לצבוע. תריס מקור האור נשלטת בדופק V 5 מועברת דרך לוח הבקרה דרך לוח D-ל-A במחשב (הדמיה RedShirt).
חלק 4: ניתוח מידע הרכישה באמצעות דימות תוכנה RedShirt
- בעקבות הרכישה, נתונים מעובד באמצעות הגדרות סינון שונות. אנחנו בדרך כלל להשתמש בהגדרות ברירת המחדל, למעט בעת כוונון בנד 'עצור / Pass מסנן, אשר מוגדר עם הגבול שמאלה 44.0 ו 98.0 הגבול הנכון. לאחר מכן המידע המוקלט מעובד סרט שנוצר (הדמיה RedShirt).
- נתונים מרכישת one המתאים הפעלת החשמל המקומית 16,384 אתרים על פני הלב על פני תקופה של 2 שניות. התוכנה מאפשרת האותות הללו המקומיים להשוות ישירות אחד עם השני ועם הקלטות electrographic פרוזדורים חדרית. הנתונים אז דמיינו ידי מיפוי ההפעלה חשמל מקומיות צבע עיבוד מידע זה כמו אנימציה המציגה את הפעלת החשמל spatiotemporal על פני הלב. כדי ליצור אנימציה כזאת, אנו משתמשים את התוכנה:
- temporally ו / או מרחבית לסנן את הנתונים
- בחר זמן התחלה וסיום של האנימציה
- מפת אותות אופטיים צבע על בסיס עוצמת האור מנוחתו של כל פיקסל
- שכבת הנתונים צבע וכתוצאה מכך עם תמונה של הלב
- ליצור את האנימציה
חלק 5: תוצאות נציג
אם הכנת הלב perfused היה ללא תנועה במהלך ההקלטה, את אותות אופטיים תערוכת יחיד שיא ברורים עבור כל פיקסל מעורב לשינוי עוצמת הפליטה של di-8-ANEPPS. הסרטים המקביל (איורים 3 ו -4) להפגין מול גל עירור ומתפשטים על פני השטח epicardial של הלב כמו גם את הקלטות electrographic רכשה בו זמנית (איור 2).
באיור 1. תצלום הכנה Langendorff-perfused לב המתאר את העמדות של האלקטרודה צעדה על אטריום הנכון א.ק.ג. מוביל כמתואר בשלב 3.2.
איור 2. אותות אופטיים נציג והקלטות electrographic מלב לואיס perfused חולדה. לוח מראה תמונה של פני השטח epicardial המשמש הדמיה אופטית. העמדה של פיקסלים שנבחרו כדי להדגים את השינויים פליטת הקרינה לאורך זמן בלוח B מסומנים על ידי חצים צבעוניים. אותות Electrographic מוצגים בלוח C עם הקו האדום המציין הפעלה פרוזדורים הקו הכחול אור המקביל לאות חדרית. בבקשהve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "> לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הסרה של הלב מן החולדות הרדים חייב להתבצע במהירות כדי למנוע איסכמיה בשריר הלב. אם איסכמיה או מספיק זלוף כלילית מתרחשת, בלב צפויה לפתח הפרעות קצב ועלולה להיות infarcted. בנוסף, לבבות אלה יציגו פליטת הקרינה מספיק הקלטות אינפורמטיבי וניתוחים שלאחר מכן. לפני טעינת צבע, בתאי שריר הלב צריך להיות perfused מספקת פתרון קרבס-Henseleit להקים ולתחזק סביבה אלקטרוליט פיזיולוגי ליציבות של דחפים חשמליים. הכנה מדויקת של perfusate הוא גם הכרחי כדי לשמור על חיוניות האיבר לתפקד תקין. הבדלים בריכוז האלקטרוליטים או סינון מספיק של perfusate יהיה כנראה להוביל בתפקוד שריר הלב קטלנית בקצב הלב הפרעות. עבור הקלטות אופטי, הלב חייב להיות טעון לחלוטין עם צבע מתח רגיש. זה חשוב במיוחד עבור שריר הלב פרוזדורים כמו אלה בתאי אינם היטב perfused על ידי העורקים הכליליים. מצאנו כי זלוף נוספים התוך cavitary של אטריה תקים אותות אופטיים טוב. יתר על כן, רכישת איכותיים העתקים מתח דורש את הלב perfused להיות תנועה אחרת, שינויים פליטת הקרינה לא ניתן להשתמש באופן אמין כדי לעקוב אחר שינויים בפוטנציאל הממברנה עם נאמנות גבוהה בשל חפצים הנגרמת על ידי סחיפה האות. זה יגרום פסגות מרובים עבור פיקסל אחד ולא שיא אחד. שיטות אחרות כדי למנוע ההצעה artifacts מהקלטות אופטי כולל קיבוע מכאני, טיפול עם עירור-התכווצות uncouplers אחרים (למשל cytochalasin D, blebbistatin), עיבוד אותות, ועל ידי מודלים מתמטיים [1, 8]. לבסוף, השיטה המתוארת כאן רק מספק מידע לגבי תנועת פעולה פוטנציאל על פני השטח epicardial לב. ההכנות רקמות חלופיות וצבעים פוטנציומטרית אינפרא אדום עשוי לפתור את מאפייני התפשטות חשמלי באזורים אחרים של הלב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש בבית החולים לילדים בבוסטון.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענקי מחקר מן המכון הלאומי לבריאות (HL068915; HL088206) ותרומות לקרן הולכה לב בבית החולים לילדים בבוסטון.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen | D-3167 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
