Summary
이 문서 potentiometric 염료 (DI - 8 - ANEPPS)를 사용 Langendorff - perfused 쥐 심장의 표면에 광학 이미지 조치 가능성이 운동에 높은 시간적 및 공간적 해상도 기법을 설명합니다.
Abstract
전압에 민감한 형광 염료로 심장 표면의 광학 매핑은 실험 모델에서 전기 자극을 조사하기위한 중요한 도구가 될 것을 셀 문화 전체 - 장기 규모 범위
Protocol
1 부 : 준비 솔루션 및 절연 perfused 심장 시스템
- 이전 [5, 6]를 설명된대로 실험의 아침, 크렙스 - Henseleit 솔루션의 4.0 L가 준비됩니다.
- 11 mMol / L 2,3 - butanedione monoxime (BDM)가 단계 1.1 준비 perfusate에서 decanted 크렙스 - Henseleit 솔루션의 1.0 L에 녹아있다.
- 크렙스 - Henseleit의 추가 150 ML은 단계 1.1 준비 perfusate에서 제거 5 몰 / L DI - 8 - ANEPPS (디메틸 sulfoxide (DMSO)에 용해 10 mMol / L 주식의 희석)로 혼합합니다.
- 5 % CO 2 가스, 이러한 3 솔루션은 물 외피 유리들은 41.0 ° C로 미리 예열 및 95 % 증가 O 2 μm의 필터링 0.2을 사용하여 잠수 버블러 (Radnoti)와 산소 아르 저수지 (Radnoti)으로 전송됩니다. 3 재고 저수지의 솔루션은 MasterFlex ™ L / S 연동 펌프와 낮은 흡수 실리콘 튜브 (콜 - 파머)와 벽 마운트 Langendorff 시스템에 펌핑하고 있습니다.
- 이전 조립, Langendorff 시스템 유리 (Radnoti)는 꼼꼼하게 E - TOXA - CLEAN 시약 (시그마 - 알드리치)으로 세탁과 철저히 0.1 M / L HCL, 100 % 에탄올 및 증류수로 씻어서 있습니다.
- 비 순환 Langendorff 장치가 물 외피 가열 코일과 거품 제거기 마음에서 분리 세 별도의 산소 저수지에서 70mm HG 정압를 제공하기 위해 만들어진 (Radnoti) [7]. 3 독립 재관류 라인은 우리가 정확하게 1.3 단계 1.1에서 준비한 솔루션의 배포를 제어할 수 있도록 2 개의 3 방향 stopcocks의 가슴 위에 수렴. 워터 외피 유리는 MasterFlex PharMed BPT 튜빙 (콜 - 파머)과 직렬로 연결되어 있고 39 ° C 예열이 E100 circulators (Lauda)를 사용하여 증류수와 함께. 것입니다 가열 코일 및 버블 트랩에 압력 머리 저수지를 연결하는 백금 - 치료의 실리콘 튜브 (콜 - 파머)를 통해 열 손실이 37 ° C perfusate 마음에 도달 결과.
2 부 : 추수 쥐 심장 설정 Langendorff 재관류
- 2백~2백50그램 루이스 쥐 깊은 전신 마취를 유발하기 위해서, 100 MG / kg 케타민을 10 MG / kg Xylazine은 intraperitoneal 캐비티에 주입합니다. 이 혼합하기 위해, 우리는 explantation 절차 동안 혈액 응고 및 심근 국소 빈혈을 방지하기 위해 500 U / kg 헤파린을 추가합니다.
- 마음과 큰 혈관에 쉽게 접근할 경우, 흉부 앞쪽에 벽이 제거됩니다. 그 후, 주변 조직은 신중하게 해부하고 pericardial 자루가 열립니다.
- 하부 대정 맥의 식별 다음,이 배는 5-0 실크 (Ethicon)와 전체 심장 폐 블록이 explanted이다와 함께 출혈도 잡았입니다. 조직은 즉시 얼음에 50 ML의 비커에 들어있는 얼음처럼 차가운 크렙스 - Henseleit 솔루션에 배치됩니다.
- 오름차순 대동맥은 신속하게 식별 및 주변 조직의 해부합니다. 적절한 규모의 정맥 (하버드 장치)가 너무 멀리 대동맥 루트에 정맥을 삽입하여 관상 동맥 재관류 의무를 방해하지 않도록주의한다, 대동맥에 삽입됩니다. 정맥은 5-0 실크 (Ethicon)로 상승 대동맥을 확보합니다.
- 쥐 심장은 다음 정맥에 공기 방울을 도입하지 않고 Langendorff 장치에 배치됩니다. 역행 관상 동맥 혈관 재관류 지금 단계 1.6에서 설명한 압력 머리에서 따뜻한 산소 크렙스 - Henseleit 솔루션으로 설정됩니다.
- 폐를 포함하여 추가 조직은, 지금은 제거하고 심장 기능의 회복을 허용하고 리듬을 안정화하기 위해 20 분 perfused입니다. 이 시간 동안 매우 얇은 열전대 온도 프로브 (콜 - 파머)은 왼쪽 심실 캐비티에 도입하고 5-0 Prolene 봉합사 (Ethicon)와 장소에서 봉합. 프로브는 심장의 온도를 보장하기 위해 온도 컨트롤러 (Digi - 센스)에 연결된 것은 37 유지 ° 물 순환 펌프의 설정을 조정하여 C. 심장 아펙스 떨어지는 perfusate에서 모션이 유출 용기 거즈 조각을 삽입하여 최소화합니다.
파트 3 : potentiometric 염료와 분산 마음과 electrographic 및 광학 신호를 획득
- DI - 8 - ANEPPS (Invitrogen)는 꼭지를 사용하여 형광 염료와 크렙스 - Henseleit 혼합을 포함하는 재관류 라인으로 전환하여 마음에로드됩니다. 또한, 18G 정맥들은 충분히 관상 동맥을 통해 도입 염료와 perfused되지 않기 때문에 천천히 이러한 챔버의 각으로 관리합니다이 염료 용액의 왼쪽 및 / 또는 마우스 오른쪽 아트리움 및 추가 50 ML에 배치됩니다.
- 로딩 절차를 수행하는 동안, 3 ECG 리드 (하버드 장치)는 부드럽게 매핑에 사용되는 광학 직면하지 않는 마음의 표면에 게재됩니다. 전극 N O 1 사후 혀끝의 좌심실 부분, N 좌심방에서 O 2, N에 위치합니다
- ECG 증폭기 (휴고 삭스 Elektronik) 설정 : 하이 패스 필터 : 0.1 Hz에서
저역 통과 필터 : 150 Hz에서 - CMOS 카메라 (레드셔트 이미징)와 macroscope은 마음의 표면에 초점이고 인수 프레임에 중심 있도록 XYZ 조정을 사용하여 배치됩니다. 카메라와 광학은 공진 주파수를 최소화하기 위해 진동 절연 테이블 (마이너스 K 기술)에 탑재하고 있습니다. 동시에, 동축 서성 거려 전극 (하버드 장치)는, 고립, S48 전기 - 자극 장치 (그라스)와 제어 오른쪽 아트리움에 배치되고 심장이 분당 300 비트 (그림 1)에서 진행됩니다.
- 전기 자극 (그라스) 설정 :
속도 : 초당 5 펄스
지연 : 0.2 MS
소요 시간 : 2 MS
볼트 : 6-12 V
모드 : 반복
펄스 : 싱글 - 수축에서 모션 아티팩트를 부족 광학 녹음 들어, 마음 electromechanically uncoupled해야합니다. 우리는 다시 11 mMol / L의 BDM을 포함 크렙스 - Henseleit 솔루션 재관류 라인을 전환하여이 작업을 수행. 인수 사이에, 마음 준비의 생존을 유지 수 있도록 완전한 크렙스 - Henseleit와 perfused 있습니다.
- 녹음 매개 변수는 다음과 같은 인수 설정 소프트웨어 (레드셔트 이미징)을 사용하여 설정됩니다 :
구성 : 2,000 Hz에서, 128x128 픽셀 어레이
프레임 간격 : 0.5 MS
카메라 앰프 게인 : 5 배
온 - 칩 이득 : 8 배속 - 12Me - 글쎄요
셔터 : 500 MS 지연
프레임 수 : 4,000
기간 : 2000 MS - 모든 객실과 장비 조명이 꺼져 있거나 촬영 중에 배경 잡음을 제거하기 위해 차폐된 수 있습니다. LED 불빛이 사진 표백과 염색 독성을 줄이기 위해서만 광학 녹음하는 동안 마음을 조명. 광원의 셔터는 컴퓨터의 D -에 - A 보드 (레드셔트 이미징)의 방법으로 제어판을 통해 전달되는 5 V 펄스로 제어됩니다.
4 부 : 레드셔트 이미징 소프트웨어를 사용하여 수집 정보를 분석
- 취득 후, 데이터가 서로 다른 필터 설정을 사용하여 처리됩니다. 우리는 일반적으로 밴드 / 스톱 44.0에서 왼쪽 경계와 98.0의 오른쪽 경계로 설정 필터를, 패스 조절 경우를 제외하고 기본 설정을 사용합니다. 나중에 기록된 정보가 처리되고 영화는 (레드셔트 이미징) 생성됩니다.
- 한 인수의 데이터는 2 초 동안 심장 표면에 16,384 사이트에서 현지 전기 활성화에 해당합니다. 이 소프트웨어는이 지역의 신호가 직접적으로 서로와 심방과 심실 electrographic 음반에 비해 수 있습니다. 데이터는 색상 지방 전기 정품 인증을 매핑하고 심장 표면에 spatiotemporal 전기 활성을 보여주는 애니메이션으로이 정보를 렌더링하여 시각입니다. 이러한 애니메이션을 만들려면, 우리는 소프트웨어를 사용 :
- temporally 및 / 또는 공간 데이터를 필터링
- 애니메이션의 시작과 끝 시간을 선택
- 각 픽셀의 휴식 광 강도에 따라 색상지도 광학 신호
- 마음의 그림과 함께 나타나는 색상 데이터를 오버레이
- 애니메이션을 생성
제 5 부 : 대표 결과
perfused 심장 준비가 녹음 도중에 움직이지 경우, 광 신호는 DI - 8 - ANEPPS의 방출 강도의 변경과 관련된 모든 픽셀에 대해 하나 별개의 절정을 보여줍니다. 해당 영화 (그림 3, 4)는 심장뿐만 아니라 동시에 취득 electrographic 기록 (그림 2)의 epicardial 표면에 걸쳐 전파 여기 웨이브 프론트를 보여줍니다.
그림 1. Langendorff - perfused 심장 준비 사진 오른쪽 아트리움에서 서성 거려 전극의 위치를 묘사하고 ECG는 단계 3.2에서 설명한 연결됩니다.
그림 2. perfused 루이스 쥐 심장에서 대표 광학 신호와 electrographic 녹음. 패널 A는 광학 이미징에 사용되는 epicardial 표면의 이미지를 보여줍니다. 패널 B에서 시간이 지남에 따라 형광 방출에 변경 내용을 증명하기 위해 선택한 픽셀의 위치는 색의 화살표로 표시됩니다. Electrographic 신호는 심방 활성화 및 심실 신호에 해당하는 하늘색 라인을 나타내는 빨간색 라인 패널 C에 표시됩니다. 주시기 바랍니다ve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg ">이 수치의 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
anesthetized 쥐에서 마음의 제거는 심근 국소 빈혈을 피하기 위해 빠르게 수행되어야합니다. 국소 빈혈 또는 불충분 관상 동맥 재관류가 발생하면 심장은 가능성이 arrhythmias을 개발하고 infarcted 될 수 있습니다. 또한 이러한 마음 유익 레코딩 및 후속 분석을 위해 충분하지 형광 방출 표시됩니다. 염료를로드하기 전에, 심근 세포 전기 자극의 안정성에 대한 physiologic 전해질 환경을 설정하고 유지하기 위해 충분히 크렙스 - Henseleit 솔루션 perfused해야합니다. perfusate의 정확한 준비는 적절한 장기 생존과 기능을 유지하기 위해 필요합니다. 전해질 농도 또는 perfusate의 불충 분한 필터링의 차이는 아마도 치명적인 심근 부전 및 심장 리듬 장애로 이어질 것입니다. 광학 녹음의 경우 심장이 완전히 전압에 민감한 염료로로드해야합니다. 이 챔버는 관상 동맥에 의해 잘 perfused되지 않는 이것은 심방 myocardium 특히 중요합니다. 우리는 심방의 추가 내부 cavitary 재관류 좋은 광학 신호를 확립 것으로 나타났습니다. 또한, 최고 품질의 전압 tracings의 취득은 perfused 마음이 움직이지 수 있어야합니다, 그렇지 않으면, 형광 방출의 변화가 안정적으로 신호 드리프트로 인한 유물로 인해 높은 충실도와 멤브레인 전위의 변화를 추적하는 데 사용할 수 없습니다. 이것은 오히려 하나의 피크 하나 이상의 픽셀에 대해 여러 개의 봉우리가 발생합니다. 광학 녹음의 모션 아티팩트를 제거하는 다른 방법은 기계적 고정, 기타 여기 - 수축 uncouplers (예 : cytochalasin D, blebbistatin), 신호 처리와 치료, 수학 모델링 [1 8]에 의해 포함됩니다. 마지막 방법은 단지 심장 epicardial 표면에 작용 잠재 운동에 관한 정보를 제공하고 여기에서 설명한. 대체 조직 준비와 적외선 potentiometric 염료는 심장의 다른 지역의 전기 전파 특성을 해결할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
동물 실험은 어린이 병원 보스톤에있는 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
그리고 어린이 병원 보스턴에서 심장 전도 기금에 기부,이 작품은 연구 국립 보건원에서 보조금 (HL088206 HL068915)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen | D-3167 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G.
- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
