Summary
Chronologischer Alterung in Hefe bezieht sich auf den Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen mit der Zeit in der stationären Phase assoziiert. Hier beschreiben wir eine High-Throughput-Verfahren zur quantitativen Bestimmung Hefe chronologische Lebensspanne.
Abstract
Die Bierhefe
Protocol
Teil 1: Vorbereitung der alternden Kulturen
- Streak-Stämmen von Interesse aus gefrorenen Beständen auf YEPD Agarplatten (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Agar, 2% Glucose).
- Inkubieren Sie die Zellen bei 30 ˚ C für 48 Stunden oder bis einzelne Kolonien erscheinen.
- Wählen Sie einzelne Kolonien und impfen in 5 ml YEPD flüssigen Medium (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Glucose) in Reagenzgläsern.
- Wachsen Kulturen über Nacht bei 30 ˚ C unter Beibehaltung konstanter Bewegung entweder mit einem Shaker oder Bandage.
- Impfen 5 ml synthetischen komplett (SC)-Medium (Tabelle 1) mit 50 ul der Übernacht-Kultur. In der Regel drei SC Kulturen sind für jeden Stamm zu dreifacher Ausfertigung biologische Replikation der Lebensdauer-Analyse für jeden Stamm untersucht bieten vorbereitet.
- Pflegen Sie die Kulturen bei 30 ˚ C unter ständigem Rühren auf eine Bandage für das gesamte Experiment (in der Regel 2 Wochen oder mehr).
Teil 2: Taking a Lebensfähigkeit Alter-Punkt
Nach zwei Tagen der Kultur in SC Medien sollten die Zellen in der stationären Phase und das erste Lebensjahr-Punkt bereit ist, entnommen werden. Nachfolgende Alter-Punkte sollte jeder genommen werden 2-3 Tage bei einem Mindestaufenthalt von zwei Wochen. Für jedes Alter Punkt:
- Bereiten Sie die Bioscreen 100-und Honeycomb-Platten für die Impfung durch das Ausfüllen jedes Well mit 145 ul der YEPD. Achten Sie darauf, mindestens ein gut gefüllt mit nur YEPD und keine Zellen für die Datenanalyse später verlassen.
- Entfernen Sie den alternden Kulturen aus dem Inkubator.
- Kurz Wirbel die erste Kultur, in die Wabenplatte geimpft werden, während sie darauf, dass keine der Kultur zu verschütten.
- Entfernen 5 ul der Mischkultur und Pipette in das erste Bohrloch des Honeycomb Platte. Flamme der Mündung jedes Reagenzglas vor und nach dem Entfernen der 5 ul-Aliquot.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden alternden Kultur sicher zu sein, die gut zu positionieren, die der jeweiligen Kultur zur Kenntnis. Identisch auch Positionen sollten für jede nachfolgende Alter-Punkt während des gesamten Experiments verwendet werden.
- Ersetzen Sie die Kulturen in den 30 ˚ C Inkubator, wenn sie mit den Impfungen abgeschlossen.
Teil 3: Laden der Bioscreen C MBR-Maschine
- Expose des Inkubators Fach durch Anheben des Deckels und entfernen Sie die Abdeckung der Probenteller.
- Legen Sie die neu geimpft Honeycomb Platte in Probenteller (verwenden Sie den linken Steckplatz, wenn Sie nur zu lesen sind eine Platte).
- Setzen Sie den Deckel auf die Probenteller und senken Sie den Deckel in den Inkubator Fach.
- Überprüfen Sie, ob der Wärmeträgerflüssigkeit wird über der minimalen Füllstand. Wenn niedrig, fügen Sie mehr mit einem 1000 ul Pipette mit dem Wärmeträger zur Verfügung gestellt.
- Mit dem Bioscreen Software "EZExperiment", die folgenden Parameter, um geeignete Wachstumskurven für Saccharomyces cerevisiae erhalten:
- Anzahl der Proben: Geben Sie die Anzahl der Brunnen mit den Medien oder 200
- Filter: 420-580nm, Wideband
- Temperatur: 30 ˚ C
- Experiment Dauer: 1 Tag, 0 Stunden, 0 Sekunden
- Messintervall: 30 Minuten
- Shaking: On, kontinuierlichem Schütteln, High
- Klicken Sie auf "Start" zu Lesungen beginnen.
Teil 4: Data Analysis
In der Regel sind sechs alters-Punkte im Laufe von zwei Wochen aufgenommen. Das Alter-Punkte sind an den Tagen 2, 4, 6, 9, 11 und 13 übernommen. Abhängig von der Versuchsplanung und-Stämme getestet, kann es wünschenswert sein Alter-Punkte mehr oder weniger häufig oder für länger als 2 Wochen dauern. Es ist wichtig, die Wabenplatte in der gleichen Reihenfolge laden für jedes Alter-Punkt, so dass jeder alternden Kultur auf die gleiche Position auch in jedem Alter-Punkt entspricht, wie dies zu machen Datenanalyse viel einfacher.
- Besorgen Sie sich die Output-Dateien aus dem Bioscreen C MBR Maschine. Die Software "EZExperiment" ausgegeben der Bioscreen Daten als tab-getrennte Datei, die kompatibel mit Microsoft Excel sowie andere Software ist. Die erste Spalte zeigt an, wann der OD-Messung wurde während des Experiments genommen, mit folgenden Spalten repräsentieren jeweils auch in der Bioscreen Honeycomb-Platten (Abbildung 1).
- Löschen Sie die erste OD Lesung aus jeder Spalte. Diese Lesart ist "Rauschen".
- Normalisieren der Daten durch Subtraktion der OD-Wert des Brunnens mit allein von allen OD-Werten in jeder Spalte YEPD. Dadurch wird der Hintergrund Absorption durch die Medien.
- Plot der Auswuchs Kurven. Die Kurven werden als Funktion des Alters (Abb. 2) zu verlagern. Zum Beispiel, indem man die Folge Kurven aus Spalte 1 (gut 1 des Honeycomb-Platte) in den sechs Zeitpunkten, gibt es eine deutliche Rechtsverschiebung der Kurven über die Zeit.
- Berechnen Sie die Verdoppelungszeit (δ) für jeden gut auf die Wachstumskinetik des Tages 2 Alter-Punkt-Basis. Die Gleichung zur Verdopplungszeit berechnen is:
wo OD 1 und OD 2 aufeinanderfolgenden OD-Messungen und t 1 und t 2 wird die Zeit zwischen den Messungen darstellen. Berechnen Verdoppelungszeiten nur zwischen OD-Werten von 0,2 bis 0,5. Der Durchschnitt dieser Werte ist die Verdoppelung Zeit für so gut. Berechnen Verdoppelungszeiten nur zwischen OD-Werten von 0,2 bis 0,5. Der Durchschnitt dieser Werte ist die Verdoppelung Zeit für so gut. Die meisten Wildtyp-Hefestämme sollte eine Verdoppelung der Zeit-Wert zwischen 85 bis 90 Minuten. - Für jedes Alter-Punkt, berechnen Sie die Zeitverschiebung (At) in das Auswachsen Kurven gegenüber der ursprünglichen Zeit-Punkt (Tag 2). Eine einfache Möglichkeit, dies zu tun ist, um den Unterschied in der Länge der Zeit, für jeden gut fand zu einer OD von 0,3 zwischen dem ersten Lebensjahr-Punkt und jedes weitere Lebensjahr-Punkt erreichen zu bestimmen. Die Zeit, die ein bestimmtes gut einer OD von 0,3 erreicht werden können aus der linearen Regressionsgleichung entspricht ln (OD) als Funktion der Zeit zwischen den beiden Zeitpunkten Bracketing OD = 0,3 berechnet werden.
- Berechnen Sie den Bruchteil überlebt in jedem Alter-Punkt, um ein Überleben Kurve (Abbildung 3) zu generieren. Definieren Sie den ersten Jahren-Punkt (Tag 2) zu 100% Lebensfähigkeit werden. Für jeden weiteren Alters-Punkt-Berechnung der prozentualen Überlebensrate nach der Gleichung:
wo s n das Überleben Prozentsatz ist, ist At n die Zeitverschiebung und δ n ist die Verdoppelung der Zeit. - Generieren Überlebenskurven (Abbildung 3B) als für jeden gut (oder replizieren Brunnen) gewünscht, indem die Fraktion (oder Prozent) der lebensfähigen Zellen als Funktion des Alters.
- Berechnen Sie das Überleben Integral (SI) für jeden gut. SI ist als die Fläche unter der Kurve Überleben definiert und können durch die Formel abgeschätzt werden:
wo Alter n ist das Alter-Punkt (zB 2, 4, 6, 9, 11 und 13) und s n ist das Überleben Wert in diesem Alter-Punkt. - Bestimmen Sie statistische Parameter replizieren Brunnen aus dem SI-und Überlebensdaten. Gemeinsamen statistischen Parameter von Interesse sind Mittelwert, Median, und die Varianz für jede Gruppe von biologischen repliziert. Ein t-Test oder ähnliche Analyse kann für paarweisen Vergleich der SI für verschiedene Versuchs-und Kontrollgruppen verwendet werden. Es kann auch wünschenswert sein, Überlebenskurven, wie in 4.8 von durchschnittlich biologischen Replikate beschrieben generieren.
Teil 5: Repräsentative Ergebnisse
Nach Beendigung des Versuchs, haben Sie geplottet das Überleben Kurve und durchgeführt Datenanalyse ausreichen, um die chronologische Hautalterung Potenzial für verschiedene Stämme oder Bedingungen zu bestimmen. Wenn korrekt durchgeführt, sollte die Wachstumskurven von der Bioscreen C MBR Maschine erhalten ähnlich aussehen wie die in Abbildung 2 dargestellt und die daraus resultierenden Überlebenskurven sollten diese in Abbildung 3 dargestellt aussehen. Im Allgemeinen wird Wildtyp-Zellen unter den hier beschriebenen Bedingungen kultiviert eine mediane chronologischen Lebensdauer in der Größenordnung von 7 Tagen. Erhebliche Unterschiede in der Überlebensrate in verschiedene Stämme und unter bestimmten Bedingungen, wie Wachstum in 0,05% Glucose Medien beobachtet wird, kann mediane Überlebenszeit 30 Tage überschreitet.
Abbildung 1. Datenausgabe aus dem Bioscreen Programm "EZExperiment". Spalte A zeigt die Uhrzeit an, einen Absorptionswert wurde. Sukzessive Säulen stellen die Vertiefungen der Honeycomb-Platte mit Zellen altern Kulturen entnommen geimpft.
Abbildung 2. Outgrowth Kurven aus einer biologischen replizieren sich im Laufe eines Experiments. Es gibt eine deutliche Verschiebung in den Kurven über die Zeit als Zellen in der alternden Kultur zu verlieren Lebensfähigkeit. Die Länge der Zeit zwischen dem ersten Zeitpunkt (Tag 2) und einer sukzessiven Zeitpunkt bestimmt Lebensfähigkeit zu diesem bestimmten Alter.
Abbildung 3. A) Ein Überleben Kurve erzeugt mit der Folge von Daten aus Abbildung 1. Der Tag 2 Zeitpunkt wird als 100% Lebensfähigkeit Punkt zu setzen. B) Final Überlebenskurven der beiden Stämme in das gleiche Experiment getestet. Diese Überlebenskurven repräsentieren die durchschnittliche Bewohnbarkeit von drei biologischen Wiederholungen für jede Anstrengung. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung innerhalb biologischer repliziert. Die schraffierte Fläche unter der Kurve stellt das Überleben des Überlebens Integral (SI) für DMS 1.
| Tabelle 1. Synthetische definierten Mediums für chronologischer Alterung Studien verwendet (Stamm background BY4743) | |
| Komponente | Konzentration (g / L) |
| D-Glucose | 20 |
| Hefestickstoffbase (-AA/AS) | 1,7 |
| (NH 4) 2 SO 4 | 5,0 |
| Adenin | 0,04 |
| L-Arginin | 0,02 |
| L-Asparaginsäure | 0,1 |
| L-Glutaminsäure | 0,1 |
| L-Histidin | 0,1 |
| L-Leucin | 0,3 |
| L-Lysin | 0,03 |
| L-Methionin | 0,02 |
| L-Phenylalanin | 0,05 |
| L-Serin | 0,375 |
| L-Threonin | 0,2 |
| L-Tryptophan | 0,04 |
| L-Tyrosin | 0,03 |
| L-Valin | 0,15 |
| Uracil | 0,1 |
Hinweis: Dieses Rezept macht Auxotrophien in diploiden BY4743 Belastung. Aminosäure Auxotrophien sollte, indem ein 5fach-Endkonzentration der synthetischen Vollmedium kompensiert werden.
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Discussion
Die High-Throughput-chronologische Lebensspanne beschriebene Assay ist hier eine effektive Methode zur Quantifizierung der Alterungspotential einer großen Zahl von Stämmen mit hoher Genauigkeit und Präzision. Der primäre Voraus dieser Methode gegenüber klassischen Methoden zur Bestimmung der Überlebenszeit durch Zählen Kolonie-bildenden Einheiten (siehe z. B. 3) ist die Verwendung eines Shakers / Inkubator / Platte Lesegerät wie dem Bioscreen C MBR-Maschine mit hoher Auflösung Wachstumskurven bei erhalten jedes Alter-Punkt. Im direkten Vergleich mit niedrigem Durchsatz chronologische Lebensspanne Assays, hat diese Methode wurde gezeigt, dass vergleichbar (oder besser) Präzision zu erreichen, während eine erhebliche Erhöhung der Anzahl der Proben, die 4 analysiert werden kann.
Die Methode, wie oben beschrieben ist geeignet für das Screening von genetischen Varianten für veränderte zeitliche Langlebigkeit unter üblichen Kulturbedingungen für Aging-Studien. Diese Methode kann leicht angepasst, jedoch werden für alternative Kultur Bedingungen, wie vor der Anpassung an Atemwegs-Wachstum (Glycerin Kohlenstoffquelle) 5, Wartung in Wasser anstatt abgelaufen Medien oder Studien über diätetische Einschränkung 4. Die Anpassung für die pharmakologische Screening-Zwecke kann auch in Betracht gezogen werden, beispielsweise durch Zugabe von verschiedenen chemischen Verbindungen aus einer Bibliothek auf die alternde Medien statt Impfen verschiedene Stämme.
Die hier beschriebene Methode bietet auch die Flexibilität in der Altersgruppe Punkte für Lebensdauer-Bestimmung verwendet. Wie oben beschrieben, sind alters-Punkte an den Tagen 2, 4, 6, 9, 11 und 13 von dem Versuch genommen. Diese Alters-Punkte eignen sich für das Screening der Hefe ORF Löschung Kollektion für Mutanten mit veränderten Lebenserwartung, aber möglicherweise nicht für andere Anwendungen Kulturbedingungen, oder genetischen Hintergründen geeignet. Es ist zu beachten ist jedoch, dass wenn der Vergleich über mehrere Experimente gewünscht wird, sollten die gleichen Alters-Punkte in jedem Experiment verwendet werden.
Im Zuge der Durchführung chronologische Lebensspanne Experimenten haben wir festgestellt, dass in regelmäßigen Abständen eine Teilmenge von Zellen in der alternden Kultur wird wieder in den Zellzyklus haben, bezeichnet ein Phänomen, das als "Keuchen" 6. Keuchend kann als eine Linksverschiebung in der Auswuchs Kurve an einer oder mehreren späteren Alter-Punkten, das entspricht einer Steigerung in der Anzahl der lebensfähigen Zellen in der alternden Kultur beobachtet werden. Kulturen, in denen keuchend aufgetreten sollte aus der Analyse entfernt werden, es sei denn, die Lebensfähigkeit bereits niedrig genug ist, dass spätere alters-Punkte werden nicht wesentlich beeinflussen SI.
Regelmäßige Wartung der Bioscreen C MBR Maschine ist notwendig, um genaue und reproduzierbare Langlebigkeit Daten zu erhalten. Es ist wichtig, dass die Wärmeträgerflüssigkeit über der minimalen Füllstand gehalten wird, und dies sollte vor jedem Lauf an der Maschine überprüft werden. Es ist auch hilfreich, um in regelmäßigen Abständen reinigen Sie den Innenraum des Inkubationskammer durch Abwischen der Schublade, um Staub zu entfernen erstellt von kontinuierlichem Schütteln des Honeycomb-Platten. Die Glühbirne muss auch einmal oder zweimal pro Jahr ausgetauscht werden. Ein F1.b2 Fehlermeldung gibt nicht genügend Licht von der Lampe ab. Es ist eine gute Idee, mehrere Ersatzbirnen auf der Hand zu halten.
Die Identifizierung von Mutanten und Chemikalien, die Lebensdauer in einfachen Eukaryoten zu verändern war eine treibende Kraft in der Altersforschung in den vergangenen Jahren. Von besonderem Interesse sind jene Eingriffe, die den Alterungsprozess verlangsamen über evolutionär unterschiedliche Arten. Die chronologische Lebensspanne beschriebene Methodik hat hier, um unser Verständnis der grundlegenden Mechanismen des Alterns in der Hefe und die Identifizierung neuer Langlebigkeit Faktoren, die letztlich erweisen können als therapeutische Targets für die Behandlung von altersbedingten Krankheiten bei Menschen beigetragen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH Grant 1R21AG031965-01A1 unterstützt. MK ist eine Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Peptone | Reagent | BD Biosciences | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | Reagent | BD Biosciences | 288620 | |
| Difco Agar | Reagent | BD Biosciences | 214530 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S. | Reagent | MidSci | J630-500G | |
| Amino Acids | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Ammonium Sulfate | Reagent | Spectrum | AM185 | |
| Dextrose | Reagent | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Bioscreen C MBR machine | Tool | Growth Curves USA | 5101370 | |
| Bioscreen 100-well Honeycomb plate | Tool | Growth Curves USA | 9502550 |
References
- Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Replicative aging in yeast: the means to the end. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29 (2008).
- Kaeberlein, M. Handbook of models for human aging. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109 (2006).
- Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73 (2003).
- Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113 (2008).
- Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast. Mech Ageing Dev. 127 (9), 733 (2006).
- Fabrizio, P., et al. Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 166 (7), 1055 (2004).
