Biology

Klein volume (1-3L) Filtratie van Coastal Zeewater Monsters

Published: June 19, 2009 doi: 10.3791/1163

David A. Walsh¹, Elena Zaikova¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

Deze video documenten klein volume (~ 1 L) filtratie van microbiële biomassa uit de waterkolom.

Abstract

De workflow begint met het verzamelen van de kust mariene wateren voor de downstream microbiële gemeenschap, nutriënten-en trace gas analyses. Voor de demonstratie van vandaag en monsters werden verzameld vanaf het dek van de HMS John Strickland die actief zijn in Saanich Inlet. Deze video documenten klein volume (~ 1 L) filtratie van microbiële biomassa uit de waterkolom. Het protocol is een uitbreiding van het grote volume bemonsteringsprotocol eerder beschreven, met een groot verschil: hier is er geen pre-filtratie stap, zodat alle grootteklassen van biomassa worden verzameld beneden de 0,22 urn filter cut-off. Monsters op deze manier zijn ideaal voor het nucleïnezuur analyse. De set-up, filtratie en clean-up stappen ieder voor zich ongeveer 20-30 minuten. Als u twee peristaltische pompen tegelijk, maximaal 8 monsters kunnen worden gefilterd op hetzelfde moment. Om te voorkomen dat biofilmvorming tussen de monsterneming reizen, moeten alle filtratie-apparatuur worden gespoeld met verdund HCl en gedeïoniseerd water en geautoclaveerd onmiddellijk na gebruik.

Protocol

Opzetten van filtratie apparatuur
1. Voor de filtering in de eerste veeg eventuele condens uit de volle flessen en wegen
2. Plaats een autoclaaf bak aan de ene kant van de pomp, en het afval fles aan de andere kant.
3. Plaats dan een volledige steekproef fles in de autoclaaf bin, maar nog niet Verwijder de dop van de fles.
4. Steek de slang door de peristaltische pomp, zodat het luer-uiteinde van de slang is in de kolf.
5. Met behulp van een pincet, verwijder de katoen uit een steriele 25 ml pipet, en bevestig de pipet naar het andere uiteinde van de slang.
Filtratie van zeewater
1. Om te beginnen filteren zeewater, opent de fles en steek de pipet. Zet de pomp aan en zet de stroomsnelheid op 1. Kijken om ervoor te zorgen dat het water wordt gepompt in de juiste richting.
2. Laat ~ 100 ml water om door de hele buis.
3. Zet de pomp en sluit een Sterivex filter om de mannelijke luer fitting aan het vrije uiteinde van de slang.
4. Ga verder filteren tot er geen water meer in de flessen.
Opslag van filters
1. Voor het opslaan van de filters, eerst te verdrijven resterende water met een 30-60 ml spuit.
2. Sluit de onderkant van de Sterivex filter met Parafilm. Met behulp van een pipet, voeg 1.8ml lysis buffer om het filter, het houden van ~ 200 ul van de ruimte in het filter voor de latere toevoeging van de reagentia.
3. Dan, seal de top van de Sterivex filter met een klein stukje Parafilm, en label de filters met de datum en monster identificatie.
4. Bewaar de filters in gelabelde 50 ml Falcon buizen op -80 ° C
Schoon te maken
1. Plaats de 25 ml pipet in een kolf met 0,1% HCl, en schakel de pomp.
2. Na de HCl wassen, spoelen van de buis met geautoclaveerd water.
  
  Tot slot, meten en registreren van de massa van de nu lege 1L flessen om de hoeveelheid water die door het filter te berekenen.

Representatieve resultaten: per stuk 1 L water steekproef levert een Sterivix filter, die biomassa groter is dan 0,22 micrometer bevat. Dit wordt opgeslagen in lysis buffer voor latere DNA-extractie en analyse. Het uiteindelijke resultaat bestaat uit een Sterivix filter per fles van 1 liter opgeslagen in lysis buffer en klaar voor DNA-extractie. Het filter bevat biomassa groter dan 0,22 micrometer. Filters kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C voorafgaand aan eDNA extractie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het is noodzakelijk om te vegen van banken en pompen met een vochtige handdoek na gebruik aan een slepende sporen van zout water die anders zouden aantasten apparatuur te verwijderen. Hoewel de procedure is eenvoudig, kan de benodigde tijd uitgebreid worden afhankelijk van de concentratie van biomassa of afval in het monster wordt gefilterd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

We willen graag de Canadese Stichting voor Innovatie, de British Columbia Kennis Ontwikkelingsfonds en de National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada te bedanken voor de ondersteuning van lopende studies op een laag zuurstofgehalte regio's van kust-en open water van de oceaan. DAW werd ondersteund door beurzen uit NSERC, Killam en de TULA basis gefinancierd Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump	Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing	Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps	Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors	Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing	ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)	Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps			For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters	EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters	Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl			For post-filtration rinse
Autoclaved water			For post-filtration rinse