Biology

तटीय समुद्र के पानी के नमूनों की छोटी मात्रा (1-3L) निस्पंदन

Published: June 19, 2009 doi: 10.3791/1163

David A. Walsh¹, Elena Zaikova¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

यह वीडियो दस्तावेजों छोटे मात्रा (~ 1 एल) पानी के स्तंभ से माइक्रोबियल बायोमास निस्पंदन.

Abstract

वर्कफ़्लो बहाव माइक्रोबियल समुदाय के लिए तटीय समुद्री जल, पोषक तत्व और ट्रेस गैस विश्लेषण के संग्रह के साथ शुरू होता है. आज प्रदर्शन के नमूने के लिए Saanich Inlet में एचएमएस जॉन Strickland के संचालन के डेक से एकत्र किए गए थे. यह वीडियो दस्तावेजों छोटे मात्रा (~ 1 एल) पानी के स्तंभ से माइक्रोबियल बायोमास निस्पंदन. यहाँ, वहाँ कोई पूर्व निस्पंदन कदम है, तो बायोमास के सभी आकार वर्गों 0.22 कट ऑफ फिल्टर सुक्ष्ममापी नीचे एकत्र कर रहे हैं: प्रोटोकॉल बड़ी मात्रा में नमूने प्रोटोकॉल पहले वर्णित है, एक प्रमुख अंतर के साथ एक विस्तार है. नमूने इस तरह एकत्र न्यूक्लिक एसिड के विश्लेषण के लिए आदर्श होते हैं. सेट अप, निस्पंदन, और स्वच्छ कदम प्रत्येक 20-30 मिनट के बारे में ले. एक साथ दो क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग अगर, 8 नमूने एक ही समय में फ़िल्टर्ड किया जा सकता है. नमूने यात्राओं के बीच biofilm गठन को रोकने के सभी निस्पंदन उपकरण पतला एचसीएल और विआयनीकृत जल के साथ rinsed होना चाहिए और उपयोग के बाद तुरंत autoclaved.

Protocol

निस्पंदन तंत्र के सेट अप
1. फ़िल्टरिंग इससे पहले, पहले पूर्ण बोतलों से दूर पोंछ किसी भी संक्षेपण और उन्हें वजन
2. पंप के एक तरफ एक autoclave बिन, और दूसरे पर बेकार फ्लास्क रखें.
3. फिर आटोक्लेव बिन में एक पूर्ण नमूना बोतल जगह है, तथापि, बोतल टोपी अभी तक दूर नहीं.
4. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के माध्यम से टयूबिंग दर्रा इतना है कि टयूबिंग की luer अंत फ्लास्क में है.
5. चिमटी का उपयोग, एक बाँझ 25 मिलीलीटर विंदुक से कपास निकालने के लिए, और टयूबिंग के दूसरे छोर पर विंदुक देते हैं.
समुद्री जल निस्पंदन
1. समुद्री जल को छानने शुरू करने के लिए, बोतल खुली और विंदुक सम्मिलित. पंप पर मुड़ें और 1 के लिए प्रवाह की गति सेट. सुनिश्चित करें कि उचित दिशा में पानी पंप किया जा रहा है देखो.
2. ~ पानी की 100 मिलीलीटर पूरे टयूबिंग के माध्यम से पारित करने की अनुमति दें.
3. पंप बंद मुड़ें और पुरुष luer फिटिंग के लिए टयूबिंग से मुक्त के अंत में एक Sterivex फिल्टर देते हैं.
4. फ़िल्टरिंग जारी रखें जब तक कोई पानी की बोतलों में छोड़ दिया है.
फिल्टर का भंडारण
1. फिल्टर की दुकान करने के लिए, पहले एक 30-60 मिलीलीटर सिरिंज के साथ किसी भी शेष पानी को निष्कासित.
2. Parafilm साथ Sterivex फ़िल्टर के नीचे सील. एक विंदुक का प्रयोग, फिल्टर करने के लिए 1.8ml lysis बफर जोड़ने के लिए अभिकर्मकों के बाद इसके अलावा के लिए फिल्टर में ~ अंतरिक्ष के 200 उल रखने.
3. फिर Parafilm का एक छोटा सा टुकड़ा के साथ Sterivex फिल्टर के ऊपर सील, और तारीख और नमूना पहचान के साथ फिल्टर लेबल.
4. पूर्व लेबल 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूबों में फिल्टर स्टोर -80 पर डिग्री सेल्सियस
क्लीन अप
1. एक 0.1% एचसीएल युक्त कुप्पी में 25 मिलीलीटर विंदुक डालें, और पंप पर स्विच.
2. एचसीएल धोने के बाद, autoclaved पानी के साथ टयूबिंग कुल्ला.
  
  अंत में मापने के लिए, और अब खाली 1L बोतलों की जन रिकॉर्ड के क्रम में फिल्टर के माध्यम से पारित करने के लिए पानी की मात्रा की गणना.

प्रतिनिधि परिणाम: प्रत्येक 1 एल पानी का नमूना एक Sterivix फिल्टर, जिसमें 0.22 सुक्ष्ममापी की तुलना में अधिक बायोमास पैदावार. यह बाद में डीएनए निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए lysis बफर में संग्रहीत किया जाता है. अंतिम परिणाम एक प्रति 1 लीटर बोतल lysis बफर में संग्रहीत Sterivix फिल्टर और डीएनए निष्कर्षण के लिए तैयार होते हैं. 0.22 सुक्ष्ममापी की तुलना में अधिक बायोमास फिल्टर शामिल हैं. फ़िल्टर -80 ° सी पहले Edna निष्कर्षण पर संग्रहीत किया जा सकता है.

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Discussion

यह उपयोग करने के लिए नमक पानी के किसी भी सुस्त निशान है कि अन्यथा उपकरण खुरचना होगा निकालने के बाद एक नम तौलिया के साथ सत्ता पक्ष और पंप करने के लिए नीचे पोंछ जरूरी है. हालांकि प्रक्रिया सरल है, समय की आवश्यकता है या फ़िल्टर्ड किया जा रहा नमूना में बायोमास मलबे की एकाग्रता के आधार पर व्यापक किया जा सकता है है.

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Acknowledgments

हम तटीय और खुले समुद्र के पानी के कम ऑक्सीजन क्षेत्रों पर चल रहे अध्ययन का समर्थन करने के लिए अभिनव, ब्रिटिश कोलंबिया नॉलेज डेवलपमेंट फंड और राष्ट्रीय विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल () NSERC के लिए कनाडा फाउंडेशन धन्यवाद देना चाहूंगा. काला कौवा NSERC, किल्लम और तुला माइक्रोबियल विविधता और विकास के लिए वित्त पोषित केंद्र नींव से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump	Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing	Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps	Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors	Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing	ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)	Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps			For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters	EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters	Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl			For post-filtration rinse
Autoclaved water			For post-filtration rinse