Biology

Volume pequenas (1-3L) Filtragem de Amostras de Água do Mar Coastal

Published: June 19, 2009 doi: 10.3791/1163

David A. Walsh¹, Elena Zaikova¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

Este vídeo volume de documentos pequenos (~ L 1) de filtragem da biomassa microbiana da coluna de água.

Abstract

O fluxo de trabalho começa com a recolha de águas marinhas costeiras para a comunidade microbiana a jusante, as análises de nutrientes e gases traço. Para amostras de demonstração de hoje foram coletados a partir do convés do HMS operacional John Strickland em Inlet Saanich. Este vídeo volume de documentos pequenos (~ L 1) de filtragem da biomassa microbiana da coluna de água. O protocolo é uma extensão do protocolo de amostragem de grande volume descrito anteriormente, com uma grande diferença: aqui, não há nenhuma etapa de pré-filtração, por isso todas as classes de tamanho de biomassa são coletados até a 0,22 mM de corte do filtro. Amostras coletadas dessa forma são ideais para análise de ácidos nucléicos. Passos que o set-up de filtração, e clean-up, cada um leva cerca de 20-30 minutos. Se usar duas bombas peristálticas, simultaneamente, até 8 amostras podem ser filtradas, ao mesmo tempo. Para evitar a formação de biofilme entre viagens de amostragem, todos os equipamentos de filtração deve ser lavado com HCl diluído e água deionizada e autoclavada imediatamente após o uso.

Protocol

Instalação de aparelho de filtração
1. Antes de filtrar, primeiro limpe a condensação das garrafas cheias e pesá-los
2. Coloque uma autoclave bin em um lado da bomba, eo frasco de resíduos no outro.
3. Em seguida, coloque uma garrafa de amostra completa no lixo autoclave, no entanto, não retire a tampa da garrafa ainda.
4. Passe a tubulação através da bomba peristáltica de modo que o fim luer do tubo é no frasco.
5. Com uma pinça, remover o algodão de uma pipeta estéril de 25 ml, e anexar a pipeta para a outra extremidade do tubo.
Filtração da água do mar
1. Para começar a filtragem da água do mar, abrir a garrafa e inserir a pipeta. Ligue a bomba e definir a velocidade de fluxo para 1. Relógio para garantir que a água está sendo bombeado na direção correta.
2. Permitir ~ 100 ml de água para passar através do tubo inteiro.
3. Desligar a bomba e coloque um filtro Sterivex ao encaixe macho luer na extremidade livre do tubo.
4. Continue até que não filtragem de água que resta na garrafa.
Armazenamento do filtro
1. Para armazenar os filtros, primeiro expulsar qualquer água restante com uma seringa ml 30-60.
2. Vedação na parte inferior do filtro Sterivex com Parafilm. Com uma pipeta, adicionar tampão de lise 1.8ml para o filtro, mantendo ~ ul 200 de espaço no filtro para adição posterior de reagentes.
3. Depois, fechar a parte superior do filtro Sterivex com um pequeno pedaço de parafilme, e rotular os filtros com a data ea identificação da amostra.
4. Armazenar os filtros pré-rotulados tubos de 50 ml falcon a -80 ° C
Limpar
1. Inserir a pipeta de 25 ml em um frasco contendo 0,1% HCl, e ligar a bomba.
2. Após a lavagem HCl, lavar o tubo com água esterilizada.
  
  Finalmente, medir e registrar a massa de garrafas de 1L agora vazia, a fim de calcular o volume de água passou pelo filtro.

Resultados Representante: Cada uma amostra de água L produz um Sterivix filtro, que contém a biomassa superior a 0,22 mM. Este é armazenado em tampão de lise para extração de DNA e análise posterior. O resultado final consiste de um filtro Sterivix por 1 litro garrafa armazenados em tampão de lise e pronto para a extração de DNA. O filtro contém biomassa superior a 0,22 mM. Os filtros podem ser armazenadas a -80 ° C antes da extração Edna.

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Discussion

É imperativo para limpar os bancos e as bombas com uma toalha úmida após o uso para remover qualquer vestígio remanescente de água salgada que de outra forma corroer equipamentos. Embora o procedimento é simples, o requisito de tempo pode ser extensa, dependendo da concentração de biomassa ou resíduos na amostra que está sendo filtrado.

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Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento e das Ciências e Pesquisa de Engenharia National Council (NSERC) do Canadá para apoiar estudos em andamento em regiões de baixo oxigênio das águas oceânicas costeiras e aberto. DAW foi apoiado por bolsas de NSERC, Killam ea fundação TULA Centro financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump	Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing	Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps	Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors	Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing	ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)	Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps			For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters	EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters	Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl			For post-filtration rinse
Autoclaved water			For post-filtration rinse