Biology

Малого объема (1-3л) Фильтрация прибрежной морской воды Образцы

Published: June 19, 2009 doi: 10.3791/1163

David A. Walsh¹, Elena Zaikova¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

Это видео документов небольшого объема (~ 1 л) фильтрации микробной биомассы из толщи воды.

Abstract

Рабочий процесс начинается со сбора прибрежные морские воды ниже по течению микробного сообщества, питательных веществ и следов анализ газа. Для демонстрации сегодня с образцы были собраны с палубы HMS Джон Стрикленд, работающих в Саанич входе. Это видео документов небольшого объема (~ 1 л) фильтрации микробной биомассы из толщи воды. Протокол является продолжением большой протокол объема выборки, описанных выше, с одним основным отличием: здесь нет никакой предварительной фильтрации шаг, поэтому все классы размеров биомассы собираются до 0,22 мкм среза фильтра. Пробы, взятые таким образом, идеально подходит для анализа нуклеиновых кислот. Настройки, фильтрации и очистки шагов каждая займет около 20-30 минут. Если с помощью двух перистальтических насосов одновременно до 8 проб могут быть отфильтрованы в то же время. Чтобы предотвратить образование биопленки между выборки поездки, все оборудование для фильтрации следует промыть разбавленным HCl и деионизированной воды и автоклавного сразу после использования.

Protocol

Настройка фильтрации аппарата
1. Перед фильтрации, во-первых стереть конденсат из полных бутылок и взвесьте
2. Место автоклаве бен на одной стороне насоса и отходов колбу с другой.
3. Затем положите полную бутылку образца в автоклаве бен, однако, не снимайте крышку бутылки еще.
4. Пропустите через трубки перистальтического насоса так, чтобы Луер конец трубки в колбу.
5. С помощью пинцета удалите хлопка из стерильной пипетки 25 мл, и приложить пипеткой на другом конце трубки.
Фильтрация морской воды
1. Для начала фильтрации морской воды, открыть бутылку и вставьте пипетки. Включите насос и набор скорости потока 1. Смотреть, чтобы вода закачивается в правильном направлении.
2. Разрешить ~ 100 мл воды, чтобы пройти через все трубки.
3. Выключите насос и прикрепить фильтр Sterivex к мужскому Луер установку на свободный конец трубки.
4. Продолжить фильтрации пока вода не осталось в бутылках.
Хранение фильтры
1. Чтобы сохранить фильтры, сначала изгнать всю оставшуюся воду с 30-60 мл шприца.
2. Уплотнение нижней части Sterivex фильтр с парафильмом. Используя пипетку, добавьте 1.8ml буфера для лизиса на фильтр, сохраняя ~ 200 мкл пространства в фильтр для последующего добавления реагентов.
3. Потом, уплотнение верхней части Sterivex фильтр с небольшой кусочек парафильмом, и этикетки фильтры с датой и образец идентификации.
4. Магазин фильтров в предварительно меченных 50 мл пробирки сокола при -80 ° C
Убирать
1. Вставьте 25 мл пипетки в колбу, содержащую 0,1% соляной кислоты, и включить насос.
2. После мытья HCl, промыть трубы с автоклавного воды.
  
  Наконец, измерения и учета массы теперь пустые бутылки 1л для расчета объема воды, пропущенной через фильтр.

Представитель Результаты: Каждый 1 л пробы воды дает одну Sterivix фильтр, который содержит биомассу более 0,22 мкм. Он сохраняется в буфере для лизиса для последующего выделения ДНК и анализа. Окончательный результат состоит из одного Sterivix фильтр в 1-литровую бутылку, хранящиеся в буфере для лизиса и готовы к экстракции ДНК. Фильтр содержит биомассу более 0,22 мкм. Фильтры могут храниться при температуре -80 ° C до извлечения EDNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Крайне важно, чтобы протереть скамейки и насосы с мокрым полотенцем после использования, чтобы удалить любые вялые следы соленой воды, которые могли бы коррозии оборудования. Хотя процедура проста, время требование может быть обширным в зависимости от концентрации биомассы или мусора в образце фильтруется.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Канадский фонд инноваций, знаний британской Колумбии Фонд развития и Национального наукам и инженерным исследованиям Совета (NSERC) Канады за поддержку проводимых исследований на регионах с низким уровнем кислорода в прибрежных и открытых водах океана. ОУПЖ была поддержана стипендии NSERC, Киллам и ТУЛА основу финансируемого Центром микробного разнообразия и эволюции.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump	Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing	Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps	Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors	Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing	ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)	Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps			For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters	EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters	Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl			For post-filtration rinse
Autoclaved water			For post-filtration rinse