Dela upp och inspelning från The C. elegans neuromuskulära förbindelsen

Summary

Tillämpning av elektrofysiologi till tillgängliga synapser ger ett kvantifierbart mått av synaptisk aktivitet, användbara i analysen synaptisk mutanter. Den här artikeln beskriver en dissektion metod som används för att exponera den neuromuskulära korsningar (NMJ) av

Abstract

Neurotransmissionen är den process genom vilken nervceller överföra information via kemiska signaler till sina postsynaptiska mål, på en snabb tid skala. Denna komplexa process kräver ett samordnat verksamheten i många pre-och postsynaptiska proteiner för att säkerställa lämplig synaptiska anslutningsmöjligheter, överledning av elektriska signaler, med inriktning och grundning av sekretoriska vesikler, avkänning kalcium, vesikelfusion, lokalisering och funktion av postsynaptiska receptorer och slutligen återvinning mekanismer. Som neuroforskare Det är vårt mål att kartlägga vilka proteiner fungerar i varje steg och förstå deras verkningsmekanismer. Elektrofysiologiska inspelningar från synapser ge en kvantifierbar läsa upp de underliggande elektriska händelser som inträffar under synaptisk överföring. Genom att kombinera denna teknik med kraftfull uppsättning molekylära och genetiska verktyg för att manipulera synaptiska proteiner i C. elegans kan vi analysera den resulterande funktionella förändringar i synaptisk transmission.

C. elegans NMJs bildas mellan motoriska nervceller och kropp muskler vägg kontroll förflyttning därför mutanter med okoordinerade motoriskt fenotyper (sk UNC s) ofta störa synaptiska överföringen på dessa synapser ^1. Eftersom UNC mutanter upprätthålls på ett rikt utbud av en bakteriell föda, är de fortfarande livskraftig, så länge de behålla en del svalget pumpning förmåga att inta föda. Detta, tillsammans med det faktum att C. elegans existera som hermafroditer, tillåter dem att föra vidare muterade avkomma utan att behöva utarbeta parning beteenden. Dessa attribut, tillsammans med vår senaste möjlighet att spela in från maskar NMJs ^2,3,7 gör detta till en utmärkt modell organism där för att ta itu exakt hur UNC mutanter påverkan neurotransmission.

Den dissektion Metoden innebär immobilisera vuxna maskarna med hjälp av en cyanoacrylic lim för att göra ett snitt i masken nagelbanden exponera NMJs. Eftersom C. elegans vuxna bara 1 mm i längd dissektionen utförs med hjälp av en dissekera mikroskop och kräver god hand-öga-koordination. NMJ inspelningar görs av hel-cellspänning fastspänning individuella kroppens celler väggen muskler och frisättningen av neurotransmittorer kan framkallas med hjälp av olika stimuleringsprotokoll inklusive elektrisk stimulering, ljusaktiverat kanal rhodopsin-medierad depolarisation ⁴ och hyperosmotic koksaltlösning, som alla kommer att beskrivs kortfattat.

Protocol

A. Beredning av verktyg som används för dissekering.

1. Den dissektion / inspelning kammare: Vi brukar konstruera inspelning kammare av en 1 / ^{16: e} tum magnetisk plåt, med ett cirkulärt hål borras i centrum som är stor nog att rymma en 22 mm diameter rund skyddsglas. De yttre dimensionerna av kammaren kommer att bero på mikroskop scenen används för att göra inspelningar. På baksidan av den magnetiska blad, fäster vi ett 48 x 60 slip mm omfattar, som vi följer i kammaren genom att placera en pellet av låg smälta Paraplax vävnad bädda vax i varje hörn av locket glida inklämt mellan glaset och kammaren . Vaxet är sedan smälte på en het plåt, glasskiva uppåt, tills den bildar ett heltäckande lager limma locket glida till kammaren. Lämna inte detta steg utan uppsikt som vaxet smälter snabbt. Kammaren bör tas bort och kylas så fort vaxet har smält. Överskott av vax som har sipprat längs innerkanten av 22mm cirkulära hålrum kan tas bort med en kant rakblad.
2. Sylgard-belagd täckglas: Den dissektion utförs på en 22 mm, Sylgard-belagd täckglas som placeras inom cirkulära hålrum av inspelningen kammaren. Den Sylgard päls hjälper cyanoacrylic lim följer locket glider när limning maskarna ner och fungerar också som en kudde som att bryta upp limmet pipettspetsen när det blir pluggad. Sylgard består färsk enligt tillverkarens anvisningar (10 delar silikon bas till 1 del härdare i vikt). En liten droppe Sylgard placeras sedan på varje täckglas och smetade över med hjälp av en kant rakblad för att göra en jämn yta. Den belagda täckglas placeras i stor täckt platt containrar och vänster i en 65 ° graders ugn över natten för att bota.
3. Pipetter: Normalt använder vi samma 1 mm ytterdiameter glödtråd borosilikatglas för att generera pipetter för limning maskar ned, nagelband snitt och inspelning från muskler, med hjälp av en elektrod avdragare. Det är lämpligt att dra en burk av pipetter innan en dissekering som detta stadium kan kräva flera snabba utbyten av pipetter.
4. Lim applikator: Lim är laddad och tillämpas från toppen av ett lim pipett genom munnen-tryck. Den limning pipetten sätts in i ena änden av en 2 fot bit av polyeten slang med en inre diameter som matchar ytterdiameter av pipetten glas (oftast 1 mm). Den andra änden av slangen har en Eppendorf pipettspetsen som fungerar som ett munstycke.
5. Extraktion pipett: Masken inälvor måste tas bort från masken hålighet när nagelbanden snitt har gjorts. Detta uppnås med en bit slang ansluten till ett Eppendorf pipettspetsen liknar limmet applikatorn men i detta fall glaset utvinning pipettspetsen bryts tillbaka tillräckligt för att ägg och inälvorna att vara lätt sugs ut ur masken hålighet.

B. dissektion

1. I inspelningen kammaren en cirkulär vax penna linje dras nära omkretsen av den avdelning som en Sylgard-belagd täckglas trycks ordentligt på plats (Sylgard-coat uppåt). Detta vax linje immobilizes täckglas och förhindrar inspelning lösningen sipprar under och lossnar locket glida under dissekering och inspelning. Kammaren fylls sedan med extracellulära inspelning lösning och flera maskar är placerade i mitten med en mask plocka. Maskar kommer att simma i lösning, dock med praktiken kan dessa maskar limmas ned utan ytterligare förfaranden såsom kyla för att förhindra rörelser. Under utbildningen skede, kan det hjälpa att träna limning muterade maskar där simning är nedsatt (t.ex. UNC-31 mutanter).
2. Ett lim container skulpterad ur en PCR-mössa som hölls i vax eller modellera, används för att hålla en fungerande lager av cyanoacrylic lim. Limma pipetter med liknande spets dimensioner till inspelningen pipetterna (normalt ~ 4 megaohms motstånd) används för att tillämpa lim. Med hjälp av lim applikator, är en liten mängd lim sugs upp i limmet pipett med dissektion möjligheter att visualisera pipettspetsen eftersom limmet sugs upp.
3. Den cyanoacrylic lim (HistoacrylBlue, Aesulap) polymerizes vid kontakt med extracellulärt inspelning lösning, därför är det viktigt att upprätthålla en positiv press på limmet pipetten när den går in i kammaren lösning för att förhindra att lim från härdning och plugga pipetten. Så snart limmet pipetten är i kammaren lösning, behöver en liten men konstant ström av lim som skall tillämpas på Sylgard ytan under mun-tryckreglering och täppa till. Om pipetten blir inkopplad det ibland kan låsas upp genom att försiktigt knacka spetsen på sylgard-belagda glas. Det rekommenderas att du tränar limma innan du försöker limma maskar. Om du kan rutinmässigt skriva ditt namn i lim på Sylgard, med bokstäver gjorda av linjer tunnare än maskar bredd du är redo att procEED till limning masken nagelbanden.
4. Att limma en mask, använd positivt tryck för att fästa en liten mängd lim till antingen huvud eller svans av masken och snabbt dra masken ner på Sylgard ytan. Försök att fästa masken nära centrum av kammaren som maskar limmade för nära kanten kommer att bli svåra att nå med inspelning pipetter. Applicera sedan en ständig ström av lim längs ryggens kanten av maskens nagelbanden från start kvarstad och tvingar masken till ett C-läge med vulva vänd inåt (för ventrala muskler inspelningar). Eventuella luckor i den här lim rad skall fyllas i så att masken är starkt knutna, för att förhindra masken från att lossna under nagelbanden snitt steg.
5. För att göra nagelbanden snitt, byta till en handhållen dissektion pipett. Detta pipett måste vara skarpare än limmet / inspelning pipetter och har en kort, kraftig axel. Använda högsta förstoring på den dissekera omfattning, anpassa pipetten parallell med den längsgående axeln på masken och sätt in tips om mittpunkten längs masken (nära vulva) gör snitt vid nagelbanden / lim gränssnitt. Detta snitt frigör maskar hydrostatiska trycket tvingar ägg och tarmar ut genom snittet punkten. Fortsätt att klippa nagelbanden mot huvudet av masken med en skiva rörelse liknar öppna ett brev, tills du når svalget. Växla över till utvinning pipetten för att suga ut de inre organen av masken. Efter clearingen snittet kommer öppnas fjällskiktet behålla sin cylindriska form. Använd en ny limning pipett att upptäcka svetsa den skurna kanten av nagelband ner på Sylgard ytan. Det är viktigt att använda minimal lim fläckar i detta skede för att undvika skador eller skymmer NMJs.
   Den ventrala nerv sladd och kropp väggen muskler är nu utsätts för.
6. För att ta bort basalmembranet som täcker NMJs, suga ut den extracellulära inspelningen lösningen från kammaren och tillämpa kollagenas (0.4mg/ml i extracellulär inspelning lösning) i ungefär 10-20 sekunder, ta av och tvätta flera gånger med färska extracellulära inspelning lösning. Gå vidare till inspelningen scenen.

C. Patch-clamp inspelning

1. Placera inspelning kammare på en upp-rätt mikroskop scenen med en 10X mål att centrera masken. Byt till en 40X vatten-emersion mål med DIC och kontrollera att kroppen väggen muskler och nerver sladden är intakta. Placera masken så att den längsgående axeln av masken är parallell med den främre kanten av omfattningen, så att elektroderna skulle införas från både vänster och höger sida.
2. Patch muskeln med vanliga patch-fastspänning tekniker. Inspelning elektroder på ca 4 megaohms motstånd fungerar bra. När elektroden rör muskeln membranet, öka negativa tryck tills ett gigohm tätning erhålls. För hela-cellspänningen-clamp inspelningsläge, använda mer sug-och zappa membranet tills gigohm tätning spruckit. I en bra inspelning, kropp vägg muskler vildtyp vuxna maskar har normalt en cell-membran kapacitans ~ 70 pF och kan vara stabilt in i minst 10 minuter på en anläggning potential -60 mV med minimal hålla strömmar (~ 50 PA).
3. Den extracellulära inspelning Lösningen består av (i mm): NaCl 150, KCl 5, CaCl ₂ 5, MgCl ₂ 4, glukos 10, sackaros 5, HEPES 15 (pH 7,3, ~ 330mOsm). Plåstret pipett innehåller (i mm): KCl 120, KOH 20, MgCl ₂ 4, (N-tris [Hydroxymethyl] mthyl-2-aminoetan-sulfonsyra) TES 5, Dihydrat CaCl ₂ 0,25, Na ₂ ATP 4, sackaros 36 , EGTA 5 (pH 7,2, ~ 312 mOsm). Obs: Dessa lösningar artificiellt belastning muskelceller med klorid, så att GABA-receptor-medierade strömmar inåt på grund av klorid utflödet på en anläggning potential -60 mV. Variationer på dessa lösningar har använts (se publikationer för detaljer).
4. Frammanade release. Normalt placerar vi en andra elektrod som innehåller extracellulära lösningen på ventrala nerv sladden främre till den lappade muskeln. Denna lös lapp konfiguration kräver stora depolariserande stimuli (på order av 10s volt) kortvarig (1-2ms) för att uppnå maximal evoked potential (vanligen 2,0-2,5 NA) i vildtyp maskar. Begränsningarna i denna strategi är: 1) Endast ett fåtal evoked potential kan levereras innan nerven sladden är oåterkalleligt skadad och 2) Av okänd anledning kan bara kolinerga evoked potential utlösas med hjälp av denna stimulans konfiguration.
5. Ljus aktiveras kanal-rhodopsin stimulans. Nyligen har Gottschalk labbet genererat transgena maskarna uttrycker alger-derived kanal rhodopsins att depolarize membranet på ljus-stimulering i delmängder av nervceller, beroende på arrangören används för att driva uttryck ^4. I fallet av C. elegans NMJ, integrerat som uttrycker kanal rhodopsin i antingen kolinerga motoriska nervceller eller GABAergic motorneuronen finns nu tillgänglig före. Eftersom kanalen rhodopsin bara svarar på ljus när all-trans-retinal är associerad med opsin fraktion måste maskar använts för denna applikation odlas på bakterier spetsad med retinal. En grön lampa puls kan sedan användas för att upprepade gånger aktivera kanalen rhodopsin orsakar framkallat utsläpp av antingen ACH eller GABA, beroende på vilken transgena maskar används. Dessa transgena maskarna kan korsas in muterade stammar. Fördelen med denna teknik jämfört med föregående elektrisk stimulering inkluderar; 1) Light-aktivering inte orsakar neurologiska skador, vilket gör att många återkommande stimuli som skall utföras och 2) Evoked släpp från antingen GABAergic eller kolinerga motoriska nervceller kan studeras oberoende av varandra.
6. Hyperosmotic-inducerad release. För att mäta storleken på lätt-öppningsbara vesikler pool (som avspeglar den sammantagna pool av primas blåsor från alla NMJ-skivor till det inspelade muskeln), en tryck-pipett innehåller hyperosmotic extracellulärt lösning (justerat till ~ 850 mOsm genom att lägga till ytterligare sackaros) används. Tryck-puls tillämpningar av 1-3 sekunder producera en flod av asynkrona postsynaptiska händelser med standardlösningar som beskrivs ovan.

Figur 1: Schematisk översikt av C. elegans dissektion och neuromuskulära inspelning konfiguration

En sylgard belagd täckglas som gjorts av utsmetning en droppe Sylgard över glaset och härdning natten placeras i cirkulära hålrum av prefabricerade inspelning kammaren och täckt med inspelning lösning. En mask placerad i centrum är limmad mot Sylgard ytan början från huvudet eller svansen, gäller lim för att ryggsidan av masken, med hjälp av ett lim pipett. När limning är klar, ett snitt intill vulva, i gränssnittet mellan nagelband och lim är gjord med ett glas nål och förlängdes mot huvudet (se rött perforerade linje). Efter utvinning av inälvor och ägg från kroppen hålighet, är den skurna kanten av snittet punktsvetsas med lim till Sylgard utsätta ventral nerven (grön) och kroppens muskler vägg (röd). Den ventrala-mediala muskler anterior till vulva är patch-fastklämd och stimulerande elektrod placeras uppströms på nerven sladden.

Representativa resultat

Helcells-, spänning-spänns kroppen väggen muskler inspelningar visas för varje av de tre stimuleringsprotokoll som beskrivs ovan (elektriskt misstänkts, ljus-framkallat och hyperosmotic svar). I samtliga fall den ventrala-mediala kroppen väggen muskler spänns fast vid -60 mV. A. vildtyp muskelceller uppvisar normalt höga endogena inåt miniatyr synaptiska strömmar i vår standard inspelning lösningar. B. En 2ms depolarisation av främre ventrala nerven sladden orsaker synkron utsläpp från flera synapser vilket resulterar i en framkallat stor respons på cirka 2-2,5 Na i vildtyp maskar. Representant spår till höger om vildtyp spår i A och B visar synaptiska ut i ett allvarligt okoordinerade mutant (UNC-18). Panel C visar en ljus-framkallat svar från den neuromuskulära förbindelsen för en vild typ mask uttrycka kanal rhodopsin i kolinerga nervceller. En 2ms ljuspuls ger normalt ett svar 1,5-1,8 NA. D. Tryck-utmatning av 850 mOsm hyperosmotic saltlösning på muskeln för 1s, producerar en asynkron störtflod av miniatyr synaptiska strömningar som representerar lätt-frisläppas pool av blåsor.

Discussion

Den genetiska modellorganism C elegans är idealiskt för studier av synaptisk transmission genom funktionell analys av mutationer i gener som kodar synaptiska proteiner. Här har vi beskrivit en dissektion teknik som gör C. elegans NMJs tillgänglig för elektrofysiologiska analys. Den medföljande videon visar de kritiska stegen i C. elegans dissektion och den typiska inspelning konfiguration används för att mäta synaptisk aktivitet. De tre stegen som utgör de största utmaningarna i att lära den här tekniken är, 1) masken limning steg, 2) att utföra en lyckad snitt, och 3) lapp på kroppen väggen muskler. När dessa har bemästrat, är denna förberedelse mottaglig för inspelningen av postsynaptiska muskel i antingen spänningen-klämma eller ström-clamp lägen. Svar på frammanade stimuli lätt kan mätas med denna dissekerat beredning i en mängd olika mutant bakgrunder. Med tanke på de redan minut storlek vildtyp vuxna masken (1 mm lång) kan synaptiska mutanter som inte når vuxen ålder eller vara magra inte vara mottaglig för denna dissektion tillvägagångssätt. Den motoriska nervceller i den ventrala nerv sladden är också mycket små (cell Soma är 2-5 mikrometer) och utgör ytterligare utmaningar för Elektrofysiologer, även om flera laboratorier har framgångsrikt spelats in från C. elegans nervceller i variationer av den dissekerade förberedelser som beskrivs här ^{5 6.}