Summary
Protokoll zur Vaccinia-Infektion von HeLa-Zellen und die Analyse von Host-und virale Genexpression.
Abstract
Die Familie
Protocol
Teil 1: Einrichten der Infektion
- Wachsen HeLa-Zellen in Flaschen und warten, bis die Zellen ca. 80% konfluent sind.
- Bereiten Sie genug virale Nährboden für das Experiment: regelmäßige DMEM mit 2% FBS und ohne Zusatz von Antibiotika.
- Die Infektion kann entweder mit einer groben Bestand von Vaccinia-Virus mit einem bekannten Titer, oder Saccharose gereinigten Virus mit einem bekannten Titer, wenn Sie über Host-Genexpression sind besorgt durchgeführt werden.
- Wenn Sie mit Saccharose gereinigte Virus sind, gehen Sie direkt zu Teil 2.
- Wenn Sie eine grobe Vaccinia-Virus Lager sind, unmittelbar vor der Infektion, beschallen ein Aliquot des Virus in eine Tasse Sonicator mit einem Bad aus hauptsächlich aus Eis und wenig Wasser.
- Ultraschallbad bei ca. 30W für 20 Sekunden.
- Vortex die Röhre, und wiederholen Sie die Beschallung 3 mal, indem mehr Eis, wenn nötig, den Kelch mit Eis gekühlt und verpackt zu halten.
- Vortex zwischen den einzelnen Beschallung Schritt.
- Fahren Sie mit Teil 2.
- Alternativ, wenn Sie nicht über eine Tasse Sonicator, mischen das gleiche Volumen des rohen Virus Lager und 0.25mg/mL Trypsin.
- Vortex kräftig.
- Inkubieren des Virus Lager / Trypsin-Mix in einem 37 ° C im Wasserbad für 30 Minuten.
- Vortex bei 5-10 Minuten-Takt.
- Fahren Sie mit Teil 2.
Teil 2: Infektion der Zellen
- Berechnen Sie die Menge von Viruspartikeln benötigt, um die Monoschicht an der gewünschten Multiplizität der Infektion (MOI) zu infizieren. Typischerweise wird ein hohes Trägheitsmoment (zwischen 5 und 10) für eine Infektion timecourses verwendet.
- Fügen Sie die gewünschte Menge an Saccharose gereinigten Virus oder trypsiniert Rohöl-Virus auf 37 ° C virale Wachstum Medien und gut mischen. Sie sollten genügend Medien gerade bedeckt den Boden des Kolbens. Zum Beispiel, 10 ml Medium für eine T-175 Kolben.
- Entfernen Sie das Medium von den Zellen und gründlich mit Raumtemperatur PBS.
- Fügen Sie die Virus / virale Wachstum Medien in jeden Kolben.
- Vorsichtig schwenken, neigen Platten und Inkubation bei 37 ° C in einer 5% igen CO2-Inkubator für 1 Stunde.
- Tilt und wirbeln Platten alle 15 Minuten, um Viren gleichmäßig verteilt und halten Zellen feucht.
- Für eine 0hr/Mock Zeitpunkt, fügen Sie das virale Wachstum Medien nur mit kein Virus hinzugefügt.
- Nach dem 1 Stunde Inkubation, entfernen Sie die Medien mit dem Virus, und spülen Sie dreimal mit PBS Raumtemperatur.
- Fügen Sie die maximale Menge des viralen Wachstums-Medium pro Flasche. Zum Beispiel, 30 mL der Medien für eine T-175 Kolben. Starten Sie das Zählen diese als 0 Std. Zeitpunkt.
Teil 3: Ernten von Zellen
- Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop und achten Sie auf zytopathischen Effekt (CPE).
- Entfernen Sie die Medien und spülen Zellen mit 30 ml Raumtemperatur PBS.
- 15 ml Trypsin zu den Zellen und inkubieren für 2-5min bei 37 ° C.
- Überprüfen Sie unter Mikroskop für Zellablösung und tippen Kolben vorsichtig, um Zellen zu entfernen.
- Transfer-Zellen mit einer sterilen serologischen Pipette in ein konisches 50 ml-Tube.
- Waschen Sie die Flasche mit dem gleichen Volumen des Zellwachstums Medien, und fügen Sie die Medien auf die Trypsin-Zellen in den konischen Rohr.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die Trypsin / Medien aus dem Zellpellet.
- Zellpellet entweder in Trizolreagenz oder der Lysepuffer aus Ihrer gewünschten RNA Isolation Kit.
- Wenn Sie TRIzol sind, teilen Sie die Probe in 1 ml Aliquots in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen beschriftet und frieren bei -80 ° C.
- Wiederholen Sie dies für alle Zeitpunkte, die Ernte ein Kolben pro Zeitpunkt.
Teil 4: RNA-Extraktion der Proben in TRIzol
- An diesem Punkt sollten Sie Ihre Proben in Trizolreagenz resuspendiert werden und bereit, verarbeitet werden.
- Add 200 ul der BCP Phasentrennung Reagenz für alle 1 ml Trizol in jeder Röhre. Möglicherweise müssen Sie die Probe auf ein größeres Rohr übertragen, wenn Sie beginnen mit einer großen Menge von TRIzol.
- Vortex oder kräftig schütteln und Inkubieren bei Raumtemperatur für 2-3 Minuten.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 xg für 15 Minuten.
- Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches Röhrchen. Die wässrige Phase wird die klare Schicht auf der Oberseite. Sie sollten sich erholen rund 600μL für jeden 1ml von TRIzol Sie begann mit.
- Haben ein zweites Phenol / Chloroform-Extraktion, diesmal mit 500μL Chloroform pro 1 ml TRIzol, anstelle von BCP.
- Vortex oder kräftig schütteln und Inkubieren bei Raumtemperatur für 2-3 Minuten.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 xg für 15 Minuten.
- Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches Röhrchen. Die wässrige Phase wird die klare Schicht auf der Oberseite.
- Add 20mg von linearen Acrylamid zu jeder Probe. Die lineare Acrylamid wirkt als Träger und hilft bei der Fällung der RNA.
- Add 500 & micro; L Isopropanol pro 1 ml TRIzol Sie begann mit jeder Probe und gut mischen.
- Inkubieren Proben bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
- Zentrifuge in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 10-15 Minuten.
- Das RNA-Pellet wird sichtbar am Boden des Röhrchens. Ganz vorsichtig den Überstand aus der Tube, entweder mit einem Staubsauger Sauger, oder manuell durch Pipette. Bitte nicht stören das Pellet.
- Waschen des Pellets mit 1 ml 70% Ethanol.
- 1 ml 70% Ethanol zum Pellet.
- Zentrifuge mit hoher Geschwindigkeit 14.000 g für 5-7 Minuten.
- Sehr vorsichtig, nehmen Sie die Ethanol aus der Tube, entweder mit einem Staubsauger Sauger, oder manuell durch Pipette. Prüfen Sie, ob das Pellet sichtbar am Boden des Röhrchens wird.
- Überstand verwerfen.
- Wiederholen Sie den Waschvorgang. Nachdem der Überstand wird verworfen, markieren, wo Pellet wird auf das Rohr.
- Der Luft trocknen lassen Pellet nicht länger als 5 Minuten. Nicht übertrocknen oder der RNA wird schwierig sein, zu rekonstruieren!
- Wenn Sie den optionalen DNase-Behandlung folgen, um alle verbleibenden DNA aus der Probe entfernt werden soll, das Pellet in 17μL von Nuklease-freies Wasser. Ansonsten das Pellet in 20 &mgr; l von Nuklease-freies Wasser und weiterhin Schritt 22 fort.
- (Optional DNase-Behandlung) mit dem Qiagen RNase-freie DNase Set, fügen 2μL Buffer RDD und 1μL rekonstituierte RNase-freie DNase I auf der resuspendierten RNA. Vorsichtig mischen.
- (Optional DNase-Behandlung) bei 37 ° C für 30 Minuten.
- (Optional DNase-Behandlung) hinzufügen 2μL von 2,5 mM EDTA und Inkubation bei 65 ° C für 5 Minuten, um die DNase zu inaktivieren. Überschreiten Sie nicht die Inaktivierung der Zeit oder Temperatur längere Zeit / höhere Temperaturen Abbau der RNA führen kann.
- Überprüfen Sie die RNA-Konzentration von Spektralphotometer.
- Bewahren Sie die RNA-Probe bei -80 ° C.
- (Optional QC) Überprüfen Sie die RNA-Qualität mittels eines Agilent BioAnalyzer, oder indem Sie die Probe auf einem denaturierenden Gel und die Kontrolle der OD. (260nm und 260/280 Ratio)
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Discussion
Kritische Schritte
Part 1 & 2
Es gibt mehrere wichtige Schritte zum Aufbau einer synchronen Vaccinia-Infektion, wobei die erste sorgfältige Ultraschall (oder trypzinizing) des Virus, um Viruspartikel aufzuschlüsseln. Vaccinia ist sehr anfällig für Aggregation, und die Störung der Viruspartikel ist dafür auch die Infektion der Zellen wichtig. Um eine synchrone Infektion zu erreichen, sollte ein hohes MOI (größer als 2) verwendet werden, um sicherzustellen, dass jede Zelle infiziert ist. Eine Mischung aus infizierten und nicht infizierten Zellen zu mehreren Runden der Infektion, heterogene Gemische von Zeitpunkten und asynchrone virale und Host-transkriptionellen Reaktionen führen. Die Infektion sollte in minimalen Mengen von Medien durchgeführt werden, um maximale Adsorption des Virus an die Zellen zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht regelmäßige Schütteln der Kolben oder Kulturschalen (alle 10 Minuten) Verteilung der Viren über den Kolben und sorgt dafür, dass die Zellen nicht austrocknen.
Teil 4
1-Bromo-3-chlorpropan (BCP) ist anstelle von Phenol verwendet, um genomische DNA-Kontamination zu reduzieren. Ein nachfolgender optional DNAse-Behandlung (Qiagen RNAase Free-DNAse) kann auch durchgeführt werden, um alle restlichen genomischen DNA zu beseitigen. Ein zweiter Chloroform-Extraktion wird verwendet, um etwaige Spuren von organischen Lösungsmittel aus der Extraktion zu entfernen, da selbst Spuren anschließende Amplifikation Schritte hemmen können. Spuren von Phenol / BCP als eine Spitze bei 270 nm (jenseits der Standard-Peak bei 260 nm) erkannt werden, wenn die Messung der Absorption von Gesamt-RNA nach der Extraktion. Wenn eine solche Kontamination erscheint, re-Extrakt der RNA (mit einem Filter oder spaltenbasierte RNA-Extraktions-Verfahren), bevor Sie fortfahren, um Verstärkung. Mindestbetrag von RNA benötigt, um Durchführen einer Amplifikationsreaktion 100 ng, aber 500-1000ng bevorzugt.
Anwendung / Bedeutung
Die markierte RNA aus diesem Protokoll kann von Menschen, virale oder benutzerdefinierte Microarrays hybridisiert werden, um die Genexpression Antworten auf infizierten Zellen in Kultur zu beurteilen. Microarray-Plattformen variieren, so folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für die Vorbereitung der Hybridisierung Mischung aus markierten Sonde.
Mit einem maßgeschneiderten Pockenvirus Array 1, konnten wir Gene in die allgemeinen Kategorien von "früh" oder "Ende" auf Timing Hybridisierungssignal basiert und ob virale DNA-Replikation für die Niederschrift Nachweis erforderlich war zu klassifizieren. Wir beobachteten den erwarteten funktionalen Kategorien von Genen in jeder zeitlichen Klasse (dh voraussichtlich Anfang, mittleren und späten Gene), wie sie auf den genauen Zeitpunkt der Transkription.
Die Methoden in dieser Arbeit verwendet werden, sind in der Lage, Viren Gene transkribiert früh oder spät im Replikationszyklus vorherzusagen, aber sie haben Schwierigkeiten zu unterscheiden früh nur gegen Gene mit einer frühen und späten Promotor seit Transkripte mit einem Dual frühen / späten Promotor kann bestehen bleiben und werden erkannt zu späten Zeiten. Darüber hinaus können Durchlauf Transkription der späten viralen Gene Signal an einer bestimmten Sonde / Spot auf dem Array beeinflussen, wie die RNA hybridisiert, um das Array aus dem ausgewiesenen ORF oder eine vorgeschaltete ORF kommen kann. Tiling Arrays haben versucht, dieses Problem zu beheben, aber Herausforderungen bleiben bei der Erkennung durch Transkription mit Hybridisierung Ansätze 2,3,4 laufen.
Host transkriptionelle Muster können auch mit Hilfe dieser Methoden werden. Allerdings kodiert Vaccinia eine Vielzahl von Mechanismen, um Host-Reaktionen hemmen, und Host-transkriptionellen Reaktionen können im Vergleich zu anderen Reizen 5,6,7,8 vermindert werden. Da die Expression vieler Gene in Immunabwehr beteiligten nach der Infektion verändert ist, sollte der Beitrag der viralen Gene, die als Host Immunantwort entgegenwirken daher berücksichtigt werden.
Mit Hilfe dieser Methoden können eine Karte der Transkriptions-Timing aller viralen Gene identifiziert und genutzt werden, um Funktionen von unbekannten viralen Gene zu verhören. Darüber hinaus können diese Methoden genutzt, um die komplizierten Dialog zwischen Virus und Wirt sezieren werden. Diese Methoden sind im Großen und Ganzen auch für andere Wirt-Pathogen-Infektion Systeme. Wenn der Erreger von Interesse nicht mRNAs polyadenyliert haben, können alternative Methoden verwendet werden, um direkt beschriften Sie die Gesamt-RNA werden, ohne lineare Verstärkung. Durch die Analyse der Wirt und Virus Genexpression während der synchronen Infektion, erlauben diese Methoden uns einen Einblick in Virus-Interaktion zu gewinnen mit dem Host-zelluläre Umgebung sowie Host-Zähler-Abwehr gegen Virusinfektionen.
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Acknowledgments
Whitehead Institute Fellows Funds
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work. |
| BCP Phase Separation Reagent | Reagent | Molecular Research Center | BP151 | |
| RNase-Free DNase Set | Reagent | Qiagen | 79254 | DNase treatment is an optional step. |
References
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