Summary
Härledning av neuroepiteliala prekursorer från embryonala stamceller (ES-celler) med hjälp av stromaceller-cellerna inducerande aktivitet (SDIA).
Abstract
ES-celler har potential att differentiera till celler från alla groddblad, vilket gör dem till ett attraktivt verktyg för utveckling av nya behandlingsmetoder. I allmänhet följer differentiering av ES-celler konceptet att först skapa omogna stamceller, som sedan kan förökas och differentieras till mogna cellulära fenotyper. Detta gäller även för ES-cellerna neurogenes, i vilken utvecklingen av neurala celler följer två viktiga steg: först härledningen och utbyggnad av omogna neuroepiteliala prekursorer och andra, deras differentiering till mogna neurala celler. En vanlig metod för att producera neurala stamceller från ES-celler är baserad på embryoid kroppen (EB) bildande, som avslöjar differentiering av celler från alla groddblad inklusive neuroectoderm. Ett alternativt och mer effektiv metod att förmå neuroepiteliala cell utveckling använder stromaceller-cellerna inducerande aktivitet (SDIA), vilket kan uppnås genom samarbete odling ES-celler med skallen härledd från benmärg stromaceller (1). Både EB bildning och SDIA, avslöjar utvecklingen av rosett-liknande strukturer, som är tänkt att likna neuralrörsdefekter-och / eller neural crest-liknande stamceller. Den neurala prekursorer kan isoleras, utökat och ytterligare differentieras till specifika nervceller och celler Glia hjälp av definierade kultur villkor. Här beskriver vi generering och isolering av dessa rosetter i samarbete kultur experiment med stromaceller cellinje MS5 (2-5).
Protocol
Steg 1
- Plate mitomycin-C ggrowth-hämmade (10 mikrogram / ml för 2,5 timmar) MS5 celler med en täthet på 70.000 / cm2 på gelatin-belagd (0,01% i 30 minuter) 6 brunnar i α-MEM media.
- När cellerna är anslutna och har bildat ett monolager (över natten tillväxt), övergå till SRM.
- Manuellt isolera kolonier ES-celler från kulturer ES-celler med hjälp av en spruta med en 27 ½ G nål.
- Tritrurate kolonierna försiktigt med en 1 ml blå spets och plattan vid låg densitet på MS5 celler (vanligtvis 2-3 kolonier per 6 brunnar).
Obs: ES-celler kan också tas från enzymatisk förökning med hjälp av kollagenas eller trypsin.
Steg 2
- Växa ES-celler på MS5 matare för 14-21 dagar tills rosett-innehållande kolonier form.
Obs: Ändra media ofta. Den rosetter är oftast i ytterkanterna av kolonierna och deras bildning kan öka betydligt om 300-500 ng / ml Noggin läggs till SRM (3). I vissa differentiering protokoll kan SRM bytas med N2-A media och kompletteras med tillväxt eller andra faktorer för att främja cell specifikation (2-5).
Steg 3
- Isolera och plocka rosetter med en 27 ½ G-nål i mikroskop.
Obs: Undvik att skära och plocka MS5 stromaceller. Om kolonier är packade med rosetter kan man isolera också hela kolonin.
Steg 4
- Aspirera kluster av rosetter, tritrurate dem försiktigt med en 1 ml blå spets, och platta dem på poly-L-Ornithine (0,001%) och fibronektin (1 mikrogram / ml) eller laminin (1 mikrogram / ml)-belagda 6 brunnar i N2-A media kompletteras oftast med bFGF (20 ng / ml). Den rosetter kommer reformer och expandera.
OBS: För att öka cellöverlevnad, kan en platta de små kluster i droppar för att öka cell densitet. Detta steg kan också ändras genom att komplettera den N2-A medier med ytterligare tillväxt eller andra faktorer för att främja cell specifikation (2-5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll visar de olika stegen i att skapa och isolera neuroepiteliala celler från mänskliga ES-celler med hjälp SDIA. Tillämpningen av denna metod är många och har använts i många protokoll för att producera specificerade nervceller (t.ex. 1, 2, 5-9). Den rosetter är tänkt att likna neuralrörsdefekter celler med en främre fenotyp (2, 5, 10) och även innehålla neural crest stamceller (11, 12). Dessutom behåller de en viss nivå av plasticitet, eftersom de kan vara mönstrad med specifika faktorer i definierade odlingsbetingelser. Därmed kan SDIA-derived neurala stamceller ger upphov till många celltyper från centrala och perifera nervsystemet vilket gör dem ett användbart verktyg för härledning av olika neurala cellpopulationer i ES paradigm celldifferentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | ||
alpha-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12571 | ||
Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | ||
Knockout-DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10829 | ||
Knockout serum replacement | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | ||
MEM nonessential amino acid solution | GIBCO, by Life Technologies | 12383 | ||
DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | ||
N2-A supplement | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
Mitomycin-C | Sigma-Aldrich | M0503 | ||
Gelatine type-A | Sigma-Aldrich | G1890 | ||
poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | 0.01% solution | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | ||
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
1 mL Syringe with 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 309623 | ||
N2-A media | medium | DMEM/F12 + 1% N2-A supplement | ||
Serum replacement media (SRM) | medium | Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine | ||
α-MEM media | medium | α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin | ||
MS5 | cell line | stromal cells | ||
Microscope | ||||
6-well Plates | for tissue culture |
References
- , Forthcoming.