Zebrafisch Gehirn Ventrikel Injection

Summary

Nach Neuralrohr Bildung, verengt die Neuroepithel und Falten, während der Schlauch füllt sich mit embryonalen Liquor (eCSF), um die embryonale Hirnventrikel bilden. Wir haben dieses Ventrikels Injektionstechnik zur besseren Visualisierung der Flüssigkeit gefüllten Raum im Gegensatz zu den neuro-Form in einer Live-Embryo.

Abstract

Proper Gehirn Ventrikels Bildung während der embryonalen Entwicklung des Gehirns ist für die normale Funktion des Gehirns benötigt. Hirnventrikel sind die hochkonservierten Hohlräume im Gehirn, die mit Liquor gefüllt sind. In Zebrafisch, nachdem Neuralrohr Bildung erfährt der Neuroepithel eine Reihe von Einschnürungen und Falten, während sie mit Flüssigkeit führt Gehirn Ventrikels Bildung füllt. Um den Prozess der Ventrikel Bildung und der neuro-Form verändert, dass zur gleichen Zeit auftreten zu verstehen, brauchen wir einen Weg, um den Ventrikel Raum im Vergleich zu den Hirngewebe zu visualisieren. Allerdings macht die Natur transparent Zebrafischembryonen es schwierig, das Gewebe aus der Herzkammer Raum zu unterscheiden. Deshalb entwickelten wir ein Gehirn Ventrikels Injektionstechnik, wo die Ventrikel Raum mit einem Fluoreszenzfarbstoff gefüllt und bebildert von Hellfeld-und Fluoreszenz-Mikroskopie. Die Hellfeld und Fluoreszenz-Bilder werden dann bearbeitet und überlagert in Photoshop. Diese Technik ermöglicht eine Visualisierung der Ventrikel Raum mit dem Fluoreszenzfarbstoff, im Vergleich zu der Form des Neuroepithel im Hellfeld Bild. Gehirn-Ventrikel Injektion in Zebrafisch kann von 18 Stunden nach der Befruchtung durch frühe Larvenstadien eingesetzt werden. Wir haben diese Technik ausgiebig in unseren Studien des Gehirns Ventrikel Bildung und Morphogenese sowie bei der Charakterisierung von Hirn-Morphogenese-Mutanten (1-3) verwendet.

Protocol

Protokoll

Teil 1: Vorbereitung für die Mikroinjektion

1. Bereiten Sie für die Injektion durch Ziehen Kapillare Nadeln mit Sutter Instruments Nadel Abzieher.
2. Füllen Sie die Nadel mit einem Fluoreszenzfarbstoff (z. B. Texas-Red Dextran).
3. Montieren Sie die Nadel in einem Mikromanipulator und Mikroinjektion Apparat.
4. Schneiden Sie die Nadel auf die entsprechende Größe in einem Winkel zu einer abgeschrägten Spitze zu schaffen.
5. Messen Sie die Tropfengröße und überprüfen, ob es zwischen 1-2nl pro Injektion ist in Öl.

Teil 2: Vorbereitung der Embryonen

1. Spritzen Sie die Embryonen 30 Minuten früher als die Bühne des Interesses. Zum Beispiel, um die Ventrikel 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF)-Studie, spritzen die Embryonen auf 23,5 hpf. Stufe die Embryonen nach Kimmel et al. (4).
2. Unter dem Stereomikroskop, entfernen Sie vorsichtig das Chorion von Embryonen mit einer Pinzette.
3. Mit einer Plastikschale mit 1% Agarose beschichtet, Löcher in die Agarose mit einem Kunststoff 1-200 ul Pipettenspitze. Entfernen Sie vorsichtig das Agarose-Plugs aus den Löchern mit einer Pinzette.
4. Übertragen Sie die Embryonen in Embryo Medien in die Agarose Schüssel mit Löchern.
5. Add Tricaine (hergestellt nach Westerfield (5)) an die Medien zu betäuben die Embryonen und verhindern, dass Bewegung während des Experiments.
6. Sanft statt der Embryo Schwanz in das Loch, und richten Sie ihn so, dass die Einspritzvorrichtung auf der hinteren Seite des Embryos ist.

Teil 3: Injektion des Gehirns Ventrikel

1. Um das Gehirn zu injizieren Ventrikel, ordnen Sie die Mikromanipulation Setup, so dass die Nadelspitze in der gleichen Sichtfeld wie der Embryo bei hoher Leistung ist.
2. Vorsichtig setzte die Nadel durch die dünne roofplate der Hinterhirn unmittelbar hinter der R0/R1 hingepoint, ohne auf das Hirngewebe unten.
3. Inject gerade genug Farbstoff vollständig zu füllen den Herzkammern. Es kann mehrere Injektionen an den Ventrikel Raum zu füllen, je nach Stadium des Embryos.

Teil 4: Imaging

1. Mit einem sauberen 1% Agarose-beschichteten Schale, poke neue Löcher in die Schale, entfernen Sie den Stecker, und fügen Sie Tricaine, die Embryonen zu betäuben und zu verhindern, Bewegung.
2. Setzen Sie den Schwanz des Ventrikels injiziert Embryo in das Loch und die Position für einen dorsalen Bild.
3. Nehmen Sie ein Bild mit Durchlicht.
4. Es ist sehr wichtig, nicht bewegen Embryo oder Mikroskop.
5. Ändern Sie die Einstellungen am Mikroskop und nehmen Sie ein Bild mit fluoreszierendem Licht.
6. Positionieren Sie den Embryo seitlichen Bilder sowohl mit Durchlicht und Fluoreszenzlicht zu nehmen.
7. Speichern Sie die Bilder als TIFF-Dateien für die Bildverarbeitung in Photoshop.

Teil 5: Image Processing

1. Zur Bearbeitung der Bilder in Photoshop, öffnen Sie den Durchlicht und Fluoreszenzlicht Bilder des gleichen Embryos in die gleiche Position eingenommen. Seien Sie sicher, dass alle Einstellungen sind die gleichen für jedes Bild.
2. Ziehen Sie Ihre fluoreszierenden Bild auf den Durchlicht Bild-und Line sie auf genau.
3. Mit den fluoreszierenden Bild ausgewählt, wählen Sie "Bild", "Einstellungen" und dann "Farbe ersetzen" und ändern Sie den schwarzen Hintergrund auf Weiß.
4. In der "Farbe ersetzen"-Fenster stellen Sie die "Unschärfe"-Faktor nach rechts, bis das fluoreszierende Bilder sieht einheitlich in der Farbe.
5. In der "Layers" Fenster, wählen Sie "Multiply", um den Overlay-Bilder zu sehen. Ihre Herzkammer Raum-Bild sollte die Durchlicht Bild exakt übereinstimmen.
6. Speichern Sie diese Datei, und wiederholen Sie für alle anderen Bilder.

Repräsentative Ergebnisse / Outcome

Proper Ventrikel Injektion Bilder sind in Abbildung 1 Platten AD gezeigt, während ein Beispiel für falsche Injektion Bilder in EH gezeigt. Proper-Injektionen haben scharfe Kanten und nicht-diffuse Farbstoff. Falsche Injektion, die, wenn die Nadel zu weit in den Ventrikel eingeführt und trifft das Hirngewebe unten auftritt, kann der Farbstoff sichtbar außerhalb des Ventrikels Platz und in den Dotter führen.

Abbildung 1. Ventrikel Injektionen von 25 hpf Wildtyp Embryonen. (AD) Korrigieren Injektionsverfahren und (EH) falsche Injektionsverfahren sind als Beispiele gezeigt. (A, E) Dorsale Hellfeld Bilder mit entsprechenden fluoreszierenden Bildern (B, F) und die Überlagerung der Fluoreszenz-und Hellfeld Bilder (C, G) sowohl für richtige und falsche Injektion Methoden gezeigt. Die Pfeile zeigen die Regionen, in denen Farbstoff über das Gehirn Ventrikels Platz aufgrund einer falschen Ventrikel-Injektion (siehe "Fehlersuche") gegangen ist. Anterior ist links in allen Bildern.

Fehlerbehebung:

Problem Ursache	Abhilfe
Sie sind Quetschen der Embryo mit der Nadel.	Ihre Nadel ist zu stumpf oder die Spitze ist zu groß.	Beginnen Sie mit einer neuen Nadel und brechen nicht so weit zurück. Bevel Ihre Nadel zu machen, scharf wie eine Injektionsnadel.
Der Farbstoff wird in den Embryo und das Eigelb (siehe Abb. 1E-H).	Ihre Nadel ging durch das Gewebe und nicht in den Ventrikel Raum zu bleiben.	Ihre Nadel kann nicht scharf genug, so dass Sie nicht in der Lage, die Geschwindigkeit der Punktion zu kontrollieren.
Der Farbstoff ist zu schwach oder nicht im Vorderhirn.	Sie setzen nicht hoch genug Druck für die Einspritzung oder Ihre Nadel war nicht weit genug anterior des Vorderhirns zu erreichen, wenn man den Farbstoff injiziert.	Steigern Sie Ihre Einspritzdruck oder platzieren Sie Ihre Nadel etwas mehr ventral während der Injektion. Sie können die Nadel durch das Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze gesetzt, wenn mehr Details im Vorderhirn erforderlich ist. Sie können auch einfach noch ein bisschen warten für den Farbstoff weiter zu verbreiten, bevor Bildgebung.
Ihre Fluoreszenz-Bilder sind zu dunkel an den Rändern nach der Farbe Ersatz in Photoshop.	Sie haben vergessen, die "Unschärfe"-Einstellung in der Farbe zu ersetzen Fensters zu ändern.	Bewegen Sie die "Unschärfe" den ganzen Weg nach rechts in die Farbe zu ersetzen Fenster.
Die Nadel wird keine Löcher in die Hinterhirn roofplate.	Ihre Nadel wird nicht geschnitten richtig.	Machen Sie eine neue Nadel. Wenn Sie dabei eine Menge von Injektionen müssen Sie unter Umständen mehrere Nadeln, wie sie bekommen können langweilig.

Discussion

In diesem Video zeigen wir, wie man Fluoreszenzfarbstoff (Texas-Red Dextran) in die Entwicklung Zebrafisch Hirnventrikel zu injizieren. Diese Methode wird verwendet, um das Gehirn Ventrikels Raum im Gegensatz zu den umliegenden Neuroepithel visualisieren und ist äußerst nützlich für die Bestimmung der Form der Ventrikel Raum sowie die Form des umgebenden Hirngewebes. Es ermöglicht uns, besser zu verstehen, den Prozess des Gehirns Ventrikel Bildung und Gehirn Morphogenese im Laufe der Zeit in der Live-Embryo. Diese Technik ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Untersuchung des Gehirns Ventrikel Bildung Mängel und für die erstmalige Charakterisierung und Untersuchung von Hirn-Morphogenese-Mutanten.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11252-20
Capillary Tubes (needles)	Tools	Frederick Haer and Co.	30-30-1
Agarose-Coated dishes	Tools	Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning)	Agarose (50027) Dishes (430166)	Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting
Dissecting Microscope	Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software	Tools
1-200 μ pipette tips	Tools	USA Scientific, Inc.	1111-0806	These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly.
Photoshop	Image Analysis	Adobe
Embryo Loop	Tools			Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax.
Microinjector	Tools	Harvard Apparatus	PL1-100
Needle Puller	Tools	Sutter Instrument Co.		Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).
Micromanipulator	Tools	Narishige International
Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	D1830	Other Molecular weights are available if desired.
Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester)	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5040
Embryo Media	Reagent			According to Westerfield (5)