Summary
Efter neuralröret bildas kontraherar den neuroepithelium och veck medan röret fylls med embryonala cerebrospinalvätska (eCSF) för att bilda den embryonala hjärnan ventriklar. Vi utvecklade denna kammare injektionsteknik för att bättre visualisera vätskefyllda utrymme i kontrast till neuroepiteliala form i ett levande embryo.
Abstract
Korrekt hjärnan kammare bildas under fosterutvecklingen hjärnans utveckling behövs för normal hjärnfunktion. Ventriklar i hjärnan är de starkt konservativa hålrum i hjärnan som är fyllda med cerebrospinalvätska. I zebrafisk, efter neuralröret bildas, genomgår neuroepithelium en serie av sammandragningar och rynkor samtidigt som den fylls med vätska vilket resulterar i hjärnan kammare bildas. För att förstå processen att ventrikeln bildas, och neuroepiteliala ändrar form som sker samtidigt behövde vi ett sätt att visualisera ventrikeln utrymme i förhållande till hjärnvävnaden. Gör dock den typ av genomskinliga zebrafisk embryon svårt att skilja vävnad från ventrikeln rymden. Därför utvecklade vi en hjärna teknik kammare injektion där ventrikeln utrymmet är fyllt med en fluorescerande färg och avbildat av brightfield och fluorescerande mikroskopi. Den brightfield och fluorescerande bilderna bearbetas sedan och överlagras i Photoshop. Denna teknik gör det möjligt för visualisering av ventrikeln rymden med fluorescerande färg, i jämförelse med formen på neuroepithelium i brightfield bilden. Brain ventrikeln injektion i zebrafisk kan användas från 18 timmar efter befruktning genom tidiga larvstadier. Vi har använt denna teknik i stor utsträckning i våra studier av hjärnans ventrikeln bildning och morfogenes samt karakterisera mutanter hjärnan morfogenes (1-3).
Protocol
Protokoll
Del 1: Förberedelser för mikroinjektion
- Förbered för injektion genom att dra kapillär nålar med Sutter Instrument nål avdragare.
- Fyll nålen med en fluorescerande färg (till exempel Texas-Red Dextran).
- Montera nålen i en mikromanipulator och mikroinjektion apparater.
- Skär nålen till lämplig storlek i en vinkel för att skapa en fasad spets.
- Mät droppstorlek och kontrollera att det är mellan 1-2nl per injektion i olja.
Del 2: Förbereda embryon
- Injicera embryona 30 minuter tidigare än stadium av intresse. Till exempel att studera ventriklarna 24 timmar efter befruktning (HPF), injicera embryon till 23,5 HPF. Steg embryona enligt Kimmel et al. (4).
- Under stereomikroskop, försiktigt bort chorion från embryon med hjälp av pincetten.
- Med hjälp av en plast skål täckt med 1% agaros, peta hål i agaros med en plast 1-200 l pipettspetsen. Ta försiktigt bort agarosen pluggarna från hålen med hjälp av pincetten.
- Överför embryon i embryot medier i agaros skålen med hål.
- Lägg tricaine (gjort enligt Westerfield (5)) till media att söva embryona och inte rör sig under experimentet.
- Placera försiktigt embryot svansen ner i hålet, och rikta den så att injektionen apparaten är på den bakre sidan av embryot.
Del 3: Att injicera hjärnan kammare
- Att injicera hjärnan ventrikeln, ordna mikromanipulation SETUP så att nålspetsen är i samma synfält som ett embryo på hög effekt.
- Försiktigt satte nålen genom den tunna roofplate av hindbrain bara posteriort om r0/r1 hingepoint utan att slå i hjärnvävnaden nedan.
- Spruta bara tillräckligt färgämne för att helt fylla ventriklarna. Det kan ta flera injektioner för att fylla ventrikeln utrymme, beroende på hur långt embryot.
Del 4: Imaging
- Använd en ren 1% agaros-belagda maträtt, peta nya hål i skålen, ta bort pluggarna och lägga tricaine att söva de embryon och förhindra rörelser.
- Placera svansen av ventrikeln-injicerade embryo i hålet och position för en rygg bild.
- Ta en bild med ljus.
- Det är mycket viktigt att inte flytta embryot eller mikroskop.
- Ändra inställningarna i mikroskop och tar en bild med lysrör.
- Flytta embryot att ta laterala bilder med både ljus och lysrör.
- Spara bilderna som TIFF-filer för bildbehandling i Photoshop.
Del 5: Bildbehandling
- Att behandla bilder i Photoshop, öppna genomlysning och lysrör bilder av samma embryot tas på samma plats. Var noga med alla inställningar är desamma för varje bild.
- Dra fluorescerande bild på det ljus bild och rada upp dem exakt.
- Med den fluorescerande bilden valts, välj "Bild", "Justeringar" och sedan "Ersätt färg" och ändra den svarta bakgrunden till vitt.
- I "Ersätt färg" fönster justera "suddighet" faktor åt höger tills den fluorescerande bilderna ser enhetlig färg.
- I "Layers" fönster, välj "Multiplicera" för att visa overlay bilder. Din kammare utrymme bild ska matcha ljus bild exakt.
- Spara filen och upprepa för andra bilder.
Representativa resultat / Utfall
Korrekt kammare injektion bilderna visas i figur 1 paneler AD, medan ett exempel på felaktig injektion bilder visas i EH. Korrekt injektioner har skarpa kanter och icke-diffusa färgämne. Felaktig injektion, som uppstår när nålen sätts för långt in i kammare och träffar hjärnvävnaden nedan kan resultera i färg som är synlig utanför ventrikeln utrymme och i äggula.
Figur 1. Ventrikeln injektioner av 25 HPF vild typ embryon. (AD) Korrekt injektion metod och (EH) felaktig injektionsteknik visas som exempel. (A, E) ryggfenan brightfield bilder med motsvarande fluorescerande bilder (B, F) och en överlagring av lysrör och brightfield bilder (C, G) för både korrekt och inkorrekt visas injektion metoder. Pilarna anger regioner där färgämnet har gått längre än hjärnan kammare utrymme grund av en felaktig kammare injektion (se "Felsökning"). Främre är till vänster i alla bilder.
Felsökning:
| Problem Orsak | Remedy | |
| Du är klämma embryot med nålen. | Din nål är för trubbig, eller spetsen är för stor. | Börja med en ny nål och inte bryta det så långt tillbaka. Avfasning din nål för att göra det vassa som en sprutnålen. |
| Färgen är hela embryot och äggulan (se figur 1E-H). | Din nålen gick igenom vävnaden och stannade inte i kammaren rymden. | Din nål kanske inte tillräckligt skarp, så att du inte kan kontrollera hastigheten på punktering. |
| Färgen är för svag eller inte i framhjärnan. | Du använde inte ett tillräckligt högt tryck för injektionen, eller din nålen var inte tillräckligt långt främre för att nå framhjärnan när du injicerat färgen. | Öka din insprutningstryck eller placera din nål något mer främre under injektionen. Du kan sätta nålen genom mitthjärnan-hindbrain gränsen om mer detaljer krävs i framhjärnan. Du kan också helt enkelt vänta lite för färgen att ytterligare sprida innan avbildning. |
| Din fluorescerande bilder är mörka runt kanterna efter färgen byte i Photoshop. | Du glömde att ändra "suddighet" inställning i färgen byta fönster. | Flytta "suddighet" hela vägen till höger i färgen byta fönster. |
| Nålen kommer inte att punktera den hindbrain roofplate. | Din Nålen är inte skära ordentligt. | Gör en ny nål. Om du gör en massa injektioner kan du behöva flera nålar som de kan få tråkigt. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna video visar vi hur du ska injicera fluorescerande färg (Texas-Red Dextran) att utveckla zebrafisk hjärnans ventriklar. Denna metod används för att visualisera det utrymme hjärnan kammare i kontrast till det omgivande neuroepithelium och är mycket användbart för att bestämma formen på ventrikeln utrymme samt formen på den omgivande hjärnvävnaden. Det ger oss möjlighet att bättre förstå processen i hjärnan ventrikeln bildas och hjärnan morfogenes över tiden i den levande embryo. Denna teknik är ett utmärkt verktyg för att studera hjärnan fel kammare bildning och för första karakterisering och undersökning av mutanter hjärnan morfogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Laura Anne Lowery som utvecklat denna teknik i labbet. HS stöds av NIHMH70926. Jennifer Gutzman stöddes av CSBi / Merck postdoktorsstipendium.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillary Tubes (needles) | Tools | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Agarose-Coated dishes | Tools | Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning) | Agarose (50027) Dishes (430166) | Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting |
| Dissecting Microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software | Tools | |||
| 1-200 μ pipette tips | Tools | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly. |
| Photoshop | Image Analysis | Adobe | ||
| Embryo Loop | Tools | Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax. | ||
| Microinjector | Tools | Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Needle Puller | Tools | Sutter Instrument Co. | Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70). | |
| Micromanipulator | Tools | Narishige International | ||
| Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | Other Molecular weights are available if desired. |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester) | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Embryo Media | Reagent | According to Westerfield (5) |
References
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B.
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. (1995).
