Summary
Hier beschrijven we een nieuwe kwantitatieve proteomics-techniek voor het identificeren van eiwitcomplexen in Saccharomyces cerevisiae. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de SILAC methode, samen met affiniteit zuivering, gevolgd door tandem massaspectrometrie te identificeren met een hoge specificiteit van de binding partners van een ER-eiwit, Scs2p.
Abstract
Vetten zijn de bouwstenen van de cellulaire membranen die als barrières en in compartimentering van cellulaire processen, en sinds kort, net zo belangrijk intracellulaire signaalmoleculen. Echter, in tegenstelling tot eiwitten, lipiden zijn kleine hydrofobe moleculen die het verkeer in de eerste plaats door slecht beschreven nonvesicular routes, die worden verondersteld voor te komen bij membraan contact sites (MCSS). MCSS zijn regio's waar het endoplasmatisch reticulum (ER) direct fysiek contact maakt met een partnering organel, bijvoorbeeld, plasmamembraan (PM). De ER deel van de ER-PM MCSS is verrijkt met lipide-synthese enzymen, wat suggereert dat lipide-synthese is gericht op deze sites en implicerend dat MCSS van belang zijn voor lipide verkeer. Gist is een ideaal model om ER-PM MCSS studie omwille van hun overvloed, met meer dan 1000 contacten per cel, en hun geconserveerd natuur in al eukaryoten. Het blootleggen van de eiwitten die MCSS vormen is van cruciaal belang om te begrijpen hoe lipiden verkeer gebeurt in de cellen, en hoe ze handelen als signaalmoleculen. We hebben vastgesteld dat een ER geroepen Scs2p lokaliseren aan ER-PM MCSS en is belangrijk voor hun vorming. We zijn gericht op het blootleggen van de moleculaire partners van Scs2p. Identificatie van eiwit complexen steunt traditioneel op de eerste het oplossen van gezuiverde eiwit monsters door gel elektroforese, gevolgd door in-gel vertering van eiwitten bands en de analyse van peptiden met behulp van massaspectrometrie. Dit beperkt vaak de studie om een kleine subset van eiwitten. Ook zijn eiwitcomplexen blootgesteld aan denaturering of niet-fysiologische omstandigheden tijdens de procedure. Om deze problemen te omzeilen, hebben we een grootschalig kwantitatief proteomics techniek om onpartijdige en gekwantificeerde gegevens te extraheren. We maken gebruik van stabiele isotopen de etikettering met aminozuren in cel cultuur (SILAC) te nieten isotoop kernen op te nemen in eiwitten in een niet-gelabelde controle stam. Gelijke volumes gelabeld cultuur en niet-gecodeerde, SILAC-label cultuur worden vermengd en gelyseerd door malen in vloeibare stikstof. We voeren vervolgens een affiniteitszuivering procedure om pull-down eiwitcomplexen. Ten slotte hebben we het eiwit neerslag monster, die klaar is voor analyse door high-performance vloeistofchromatografie / tandem massaspectrometrie. Nog belangrijker, worden eiwitten in de controle stam gelabeld door de zware isotoop en zal een massa / lading shift die kan tegen de niet-gelabelde eiwitten worden gekwantificeerd in het aas stam te produceren. Daarom kunnen verontreinigingen of niet-specifieke binding gemakkelijk kunnen worden verwijderd. Door deze aanpak, hebben we een aantal nieuwe eiwitten die lokaliseren aan ER-PM MCSS. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van onze aanpak.
Protocol
Materialen en methoden
- Giststammen
- Alle stammen die in deze studie zijn gebaseerd op de BY4742 achtergrond. De SILAC controle stam (Mat een, his3, leu2, ura3, lys2 en Arg4:: G418) werd gemaakt door voortplanting Arg4 verwijdering stam (Mat een, his3, ura3, leu2 en Arg4:: G418) naar BY4742 (Mat alpha, his3, leu2, ura3 en lys2), en de meiotische haploiden werden verkregen door tetrade dissectie. Dat de controle op stam is een auxotroph voor lysine en arginine. Het aas stam werd gemaakt door PCR-gemedieerde homologe recombinatie behulp van de vector pBS1479. Daarom is het epitoop-tag die in deze studie is de tandem affiniteitszuivering (TAP) tag (3).
- SILAC:
- De SILAC controle stam werd gekweekt in een minimale uitval media aangevuld met 98% L-lysine-4 ,4,5,5-D4 (0,03 g / L, Cambridge Isotopen) en 98% L-arginine-13 C 6 (0.036 g / L, Cambridge isotoop).
- Het aas stam werd gekweekt in reguliere rijk medium met een normaal isotopische aminozuren.
- Eerste fase van TAP zuivering [Dit protocol is een bewerking van het Cold Spring Harbor Laboratory cursusboek (4)]
** De avond voor uw zuivering, pre-chill mortier en een stamper in de -80 ° C vriezer. Ook pre-chill een beker in de -20 ° C **
Maak deze buffers vlak voor gebruik (voor 1 L van cultuur):- 30 ml NP-40 buffer met 25 ul PIC (1 / 2000), 50 ul van 1 M DTT
- 20 ml van de NP-40 buffer met 1 / 200 PIC, 50 ul van 1 M DTT
- 10 ml van de TEV-C buffer met 1 / 2000 PIC, 10 ul van 1 M DTT
SILAC en voorbereiding
- Grow 1L elk van de aas stam en de controle apart stam aan OD 600 = 1,0-1,3.
- Giet cultuur in 500ml Nalgene centrifugebuis. De balans van de belasting en de pellet cellen op 2580X g.
- Giet media en resuspendeer pellet met 50 ml koud dH 2 O, terwijl de overdracht van de cellen tot 50 ml centrifugebuis. Pellet cellen. ** U kunt de pellet bevriezen bij -80 ° C **
- ** Belangrijk ** overeenkomen met de controle stam cultuur naar het aas stam cultuur in 01:01 door droge pellet gewicht.
- Resuspendeer elke cel pellet in 10 ml van de NP-40 buffer met 1 / / 2000 proteaseremmer Cocktail (PIC).
- Meng de twee celculturen door direct decanteren een naar de andere buis.
Slijpen - Giet vloeibaar N 2 in de pre-gekoelde mortel en laat het dan volledig verdampen. Voeg 2 ml van cellen om de mortel in cirkelvormige beweging. Giet wat vloeistof N 2 om de cellen te bevriezen. Maal de cellen totdat de cellen fijn poeder. Herhaal dit proces totdat alle cellen zijn grond. ** Zorg ervoor dat de cellen te ontdooien. Voeg vloeibare N 2 indien nodig **
- Breng het poeder aan een ijskoude beker en ontdooien bij kamertemperatuur. Als de randen beginnen te ontdooien, voeg 20 ml van de NP-40 buffer met 1 / 200 PIC.
- Overdracht ruwe lysaat tot 40-ml Nalgene buizen. Draaien op 39.000 xgfor 30 minuten.
- Tijdens het wachten, neem 300 ul van Sepharose 2B kralen (GE). Was de kralen in 300 ul van de NP-40 buffer (1 / 2, 000 PIC) drie keer. Resuspendeer de kralen in 300 ul buffer, zodat ze in een 1:1 slurrie.
Pre-clearing cellysaat - Breng het supernatans naar een nieuwe buis en voeg de Sepharose 2B kralen. Incubeer op een draaiend platform in een koude ruimte voor 30 minuten.
- Tijdens het wachten, neem 300 ul van IgG Sepharose 6 kralen (GE). Was de kralen in 300 ul van de NP-40 buffer (1 / 2, 000 PIC) drie keer. Resuspendeer de kralen in 300 _l buffer, zodat ze in een 1:1 slurrie.
- Pellet de kralen. Breng het supernatans naar een nieuwe buis. ** Een aliquot van de cel lysaat Opslaan voor Western blotting later **
Binding aan IgG sepharose kralen - Verwijder de Sepharose 2B kralen door centrifuge. Voeg de IgG beads (voorheen opgesteld in 01:01 slurry). Scheid de inhoud in twee buizen voor meer efficiënte binding. Incubeer op een draaiend platform in een koude kamer voor 2 uur.
- Spin down van de kralen. ** Bespaar een hoeveelheid van de ongebonden fractie **
- Was kralen met 10 ml NP-40 buffer (1 / 2, 000 PIC).
- Was kralen met 3 ml TEV-C buffer (1 / 2, 000 PIC). ** Bespaar een hoeveelheid van de kralen. Hierin komt de efficiëntie van bindende **
Eluerende van IgG kralen door TEV protease klieving - Voeg 5 pl AcTEV tot 1 ml TEV-C buffer (met 1 / 2, 000 PIC). Na het mengen, scheiden van de inhoud in twee 1,5 ml Eppendorf buizen voor een efficiëntere vermenging. 'S nachts incuberen op een draaiend platform in een koude kamer.
- Spin down de kralen en breng het eluaat om een nieuwe 1,5-ml-buis. Was de kralen met extra 0,5 ml van de TEV-C buffer
- Combineer de elaute in een buis. Je moet 1,5 ml van het eluaat in totaal.** Bespaar een hoeveelheid van de TEV eluaat **
Trichloorazijnzuur (TCA) precipatation (voor massaspectrometrie-gebaseerde analyse, raden we met behulp van EtOH / acetaat neerslag) - Stel aliquots tot 25% TCA met 100% TCA. Om dit te doen, los van de 1,5 ml eluaat in 2 buizen van 750 ul per stuk. Voeg 250 ul van 100% TCA aan de buis. Uw oplossing moet draaien melkachtig.
- Plaats op ijs gedurende 30 minuten met periodieke vortexen.
- Draaien op maximale snelheid in de tabel-top centrifuge in koude ruimte voor 30 minuten.
- Was eenmaal met 500 pi van ijskoude aceton met 0,05 N HCl en spin gedurende 5 minuten op maximale snelheid (koude kamer).
- Was eenmaal met 500 pi van ijskoude aceton en spin voor 5 min op max (koude kamer).
- Verwijder voorzichtig aceton en droog pellet.
- Voor zilver kleuring, resuspendeer de pellet in 50 ul van 1X SDS sample buffer.
EtOH / acetaat precipatation - Voeg 20 ug van glycogeen
- Verdunnen monsters 5X met 100% EtOH en aan te passen aan 50 mM NACH 3 COO met een 2,5 M voorraad, pH 5,0
- Staan de oplossing voor 2 uur
- Pellet neergeslagen eiwit door centrifugatie gedurende 10 min bij 12.000 X g bij kamertemperatuur.
NP-40 buffer (voor 200 ml)
| Stock concentratie | Toevoegen | |
| 10 mM natriumfosfaat buffer (pH 7,2) | 0,1 M | 20 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 15 ml |
| 1% NP-40 | 100% | 2 ml |
| 50 mM NaF | 1 M | 10 ml |
| 0,1 mM Na 3 VO 4 | 10 mM | 2 ml |
| Volume tot 200 ml | ||
ADD voor gebruik:
- 1 / 1, 000 van 1 M DTT
- 1 / 2, 000 van de PIC (proteaseremmers Cocktail)
TEV-C Buffer (voor 50 ml)
| Stock concentratie | Toevoegen | |
| 25 mM Tris (pH 8,0) | 100 mM | 12,5 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 3,75 ml |
| 0,1% NP-40 | 100% | 50 _l |
| 0,5 mM EDTA | 500 mM | 50 __l |
| Volume op 50 ml | ||
ADD voor gebruik:
- 1 / 1, 000 van 1M DTT
- 1 / 2, 000 van de PIC
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fracties opgeslagen tijdens de zuivering procedure moet omvatten (1) pre-gewist cellysaat, (2) gebonden fractie, (3) niet-gebonden fractie, en (4) geëlueerd fractie. Wij raden aan het analyseren van het eiwit inhoud van de bovenstaande aliquots door Western blotting gebruik van anti-TAP antilichaam of zilverkleuring om de binding en het elueren van de efficiëntie van het experiment weer te geven. Voorbeelden van een zilveren gekleurde gel en een blot worden weergegeven in Figuur 1.
Sinds SILAC voorziet ons van onpartijdige en gekwantificeerd metingen van eiwitbinding partners, doen we alleen de eerste fase van de TAP zuivering te proeven verlies te minimaliseren. Als u grote hoeveelheden niet-specifieke binding, kunt u het uitvoeren van de gehele protocol, dat kan worden gevonden in het Cold Spring Harbor handleiding (4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 Forthcoming.
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 Forthcoming.
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 123-125 Forthcoming.
