Summary
Intravitale photoswitching en het bijhouden van Dendra2-gemerkte tumorcellen door de borstklieren Imaging Window is een techniek die ons in staat stelt om het imago van de metastatische gedrag van tumorcellen in de gekozen tumor micro-omgevingen op een tijdschaal van dagen.
Abstract
In het laatste decennium, intravitale microscopie van borsttumoren bij muizen en ratten op single-cell resolutie
Protocol
1. Generatie van fluorescente tumoren met behulp van injectie van tumorcellen in het uiervet pad:
- Grow een cellijn die Dendra2 eiwit (als een cytoplasmatisch marker) tot 40 - 80% confluentie.
- Spoel schalen ten minste drie keer met PBS w / o Ca 2 + of Mg 2 +.
- Voeg 3 ml trypsine per 10 cm schotel en incubeer bij 37 ° C tot het grootste deel van de cellen vervolgens los en druk op de schotel tegen een vlakke ondergrond om het te schudden.
- Spoel alle cellen uit de schotel, en het gebruik van een schraper (rubber politieman) om matrix te verzamelen ook. Voeg de 5 ml PBS. Neem een hoeveelheid te tellen tijdens het centrifugeren.
- Centrifugeer bij 800 g gedurende 5 minuten.
- Aspireren en resuspendeer in PBS tot een concentratie van 5 - 10x 10 6 / ml. Op te slaan op ijs tot geïnjecteerd (injecteren binnen 30 min).
- Plaats een kooi met 4-5 week oude vrouwelijke immuun deficiënte muizen (bijvoorbeeld SCID) in een steriele kap.
- Spray het gebied rond de 4e (buik) tepel met 70% ethanol.
- Injecteer 0,1 ml in uiervet pad. Als een assistent kan worden gevonden, een persoon kan de muis zijn plaats te houden, terwijl de andere voegt de naald in de uiervet pad. Als u het injecteren zelf, zet de muis onder lichte verdoving met behulp van isofluraan.
- Nadat de tumor is gegroeid tot 5-7 mm, moet de borstklieren Imaging Window (MIW) te worden opgenomen.
Opmerking: Als alternatief, voor sommige toepassingen, het MIW kan worden geplaatst op de top van de gezonde uiervet pad en de cellen kunnen daarna geïnjecteerd worden. Die aanpak maakt het mogelijk beeldvorming van transient getransfecteerde cellen in een fysiologische omgeving.
2. Handmatige fabricage van de borstklier Imaging Window (MIW):
- MIWs (Figuur 1A) zijn gemaakt van weefsel grade plastic te biocompatibiliteit te garanderen. Voor de handmatige bouw, gebruiken we 5 of 10 cm schotels.
- Zet latex handschoenen aan.
- Verwarm een tissue-cultuur schotel en creat een gebogen oppervlak door op een ronde, hard voorwerp tegen het verwarmde schotel (we gebruiken een 1-inch dremmel bit voor deze).
- Knip het midden van de schotel met behulp van een verwarmde scheermesje.
- Gebruik een kleine, kegelvormige dremmel bit om een gat te maken in het midden van de koepel-vormige plastic basis (6-7mm in diameter).
- Maak de randen van de kunststof bodem helemaal glad door schuren met de dremmel en verder het indienen van het.
- Bestand de bovenkant van de plastic basis het maken van een vlakke ondergrond voor het glas dekglaasje aan. De diameter van de ingediende, vlakke ondergrond moet worden 9-10mm.
- Lijm de 8mm ronde glazen dekglaasje (nummer 1) op de afgevlakte oppervlak met behulp van de secondenlijm (cyanoacrylaat lijm).
- Wacht tot de lijm drogen (15 minuten).
- Gebruik een verwarmd 26G naald om acht hechten gaatjes prikken van buitenaf (waar het glas is) aan de binnenzijde van de basis te maken. Gaten moeten gelijkmatig worden verdeeld over de hele dekglaasje, 0,5-1mm afstand van de rand van het dekglaasje.
- Verbreed de gaten met behulp van een 5-0 hechten naald.
- Prikken gaten in de plastic basis zal de binnenkant oneffen. Met behulp van schuurpapier, maken dit oppervlak volkomen glad.
- Wijzig de handschoenen en borstel van kleine plastic deeltjes uit de MIW met een kleine borstel.
- Was de MIW met gedeïoniseerd water.
- Was de MIW met 70% ethanol. Gebruik een wattenstaafje om het glas te reinigen dus het is volledig transparant. Als er mistige plekken aanwezig zijn van de lijm damp, zorgvuldig gebruik van aceton met een Q-tip.
- Steriliseer de MIW door UV-belichting voor 3 uur aan elke zijde.
Semi-Manual fabricage van de borstklier Imaging Window (MIW):
Met het oog op de plastic basis fabriceren, zijn we momenteel met behulp van siliconen rubber gietmallen gemaakt met de hand gemaakt MIWs. De mal bestaat uit twee delen van siliconen rubber, dat een exacte replica van zowel de voor-en achterzijde van het origineel wanneer gevuld met polyester hars en dan meteen met elkaar verbonden te maken. De vloeibare polyesterhars is samen 9:10 gemengd en resulteert in een harde structuur indien volledig genezen in 48h. Het plastic is UV beschermd en archivering, zonder te breken of te worden geel na verloop van tijd.
Nadat de basis is genezen, stappen 2.8-2.16 worden op dezelfde manier gedaan als voor het handmatig gemaakt MIWs.
3. Insertie van het MIW:
- Het gebied rond de 4 e tepel moet een klein (5-7 mm diameter) tumor enkele dagen / weken na de injectie van tumorcellen, afhankelijk van het celtype (Figuur 1B). Hoeveel tijd is verstreken na de injectie van de cellen die Dendra2 photoswitchable eiwit of andere fluorescerende eiwitten afhankelijk van de gebruikte cellijn. De tumor mag niet worden zichtbaar necrotische, en moet een intacte huid met haar op de top van de tumor te hebben. Muizen met necrotische tumoren dienen te worden geëuthanaseerd.
- Bereid de steriele ruimte voor de operatie-vast een stuk van steriele doek in een steriele kap. Leg een stukje van steriele gauze in het midden, en leg een paar MIWs en steriele instrumenten omheen: we gebruik maken van kleine standaard scharen, de lente schaar, pincet microdissecting, microdissecting tang, naaldhouder. Houden steriele Q-tips, een flesje van 70% ethanol en steriele handschoenen in de hoek van de motorkap.
- De muis is verdoofd in de steriele kap met behulp van IP-injectie van 2,5% Avertin (20 ul / g) in HBSS of, als alternatief 10 ug / kg ketamine + 10 ug / g xylazine (neem contact op Animal Care Instituut voor goedkeuringen en bestellen).
Let op: Avertin oplossing dient te worden voorbereid tweewekelijks, filter gesteriliseerd met behulp van een 0,22 um filter en opgeslagen als 500 ul aliquots bij 4 ° C (in het donker). - Verwijder de haren door het scheren het gebied boven de tumor met behulp van een klein dier scheerapparaat.
- Verwijder de rest van het haar met behulp van Nair ontharingscrème (verkrijgbaar in elke drogist). Reinig de huid met behulp van ethanol-gedompeld Q-tips.
- Breng het dier naar de steriele gaas en toe te passen oogzalf om de ogen te houden uitdrogen en infectie.
- Steriliseer de huid met betadine en schoon met 70% ethanol.
- Breng het dier op een steriele chirurgische doek in de steriele kap.
- Trek de huid onmiddellijk mediaal van de tepel met behulp van pincet en knip ~ 2 mm incisie in de huid.
- Gescheiden van de onderliggende uiervet pad van de huid met behulp van dissectie schaar en pincet. De huid en kontje op te rekken tijdens deze scheiding stap naar een formaat dat het inbrengen van de MIW zal plaats bieden.
- Als per ongeluk een schip is geraakt tijdens het sugery, gebruik dan een steriele Q-tips om geen bloed, dat wordt geproduceerd op / om het bloeden te stoppen te groot te verwijderen.
- Plaats de MIW zodanig dat er de huid op de top van de MIW basis en hechtdraad op zijn plaats met behulp van niet-resorbeerbare draad en omgekeerd snijden van de naald.
- Gebruik weefsel lijm of cyanoacrylaat in te vullen hechten gaten en de MIW veilig voor de huid.
- Voeg TMP-SMX antibiotica mix: (Sulfamethoxazol 0,6 mg / ml, Trimethoprim 0,12 mg / ml) in de kooi water fles voor 3 dagen voor en na de operatie.
- Het dier blijft onder narcose voor een-4h na Avertin IP-injectie. Aangezien de ingreep meestal duurt ~ 45min, is het belangrijk om te helpen het dier daarna te herstellen:
- Plaats een hand verwarming pad (37 ° C) (verkrijgbaar in drogisterijen) op de bodem van de kooi en dek deze af met gaas.
- Houd het dier op de top van het pad totdat deze op zijn buik en begint te lopen.
- Als het dier bewusteloos is voor meer dan 3 uur, injecteer 0,3 ml HBSS intraperitonaal voor rehydratatie.
- Het dier is toegestaan om te herstellen in de komende 3-4 dagen voor de eerste opnamesessie plaatsvindt.
4. Imaging Box Bouw
De imaging box zorgt ervoor dat het MIW is vlak zit, recht boven de microscoop doelstelling. Het vergemakkelijkt ook de temperatuur en de anesthesie controle door middel van een constante luchtstroom van isofluraan. De box is gemaakt van plexiglas en aan elkaar gelijmd met behulp van plastic lassen. Het is geschikt voor de specifieke microscoop podium en dus de vorm van de bodem is afhankelijk van de microscoop gebruikt (Figuur 2 toont het schema van de doos gemonteerd Leica SP5 microscoop stadium).
Afmetingen van de doos in centimeters zijn l = 11,4 cm, B = 7,6 cm, h = 4,4 cm (figuur 2A). De onderkant van de doos bestaat uit een holle plaat, 12.7x8.4 cm groot, die past in de Leica SP5 microscoop podium, en twee schuifdeuren "deuren", 5,7 X 5,7 cm_each, die een ronde opening (formulier d = 2,22 cm ) gesloten. Het MIW past in deze opening. Het voorpand bevat de inlaat gat voor de anesthesietoediening terwijl een van de zijstukken bevat een afvoeropening die leidt tot het vacuüm.
Merk op dat de condensor en de dia houder moet worden verwijderd voordat de beeldvorming box plaatsing.
5. Imaging Box gebruik
- Plaats het dier onder narcose met isofluraan en toe te passen oogzalf voor de ogen.
- Bevestig de isofluraan uitlaat van de narcose machine naar de beeldvorming box voorkant, aan de buitenkant van de inlaat gat (Figuur 2B).
- Bevestig een tweede buis op de uitlaat gat van de imaging-box. Deze buis moet worden gehecht aan de gas-filter en vervolgens naar het vacuüm.
- Open het deksel en open de doos deuren en plaats het dier, MIW zijde naar de bodem, en schuiven de deuren in de doos.
- Houd de doos en pas de deuren in de bodem, zodat het MIW basis is gehouden en geïmmobiliseerd tussen hen. Het MIW basis moet op hetzelfde niveau als de beeldvorming box deuren, terwijl de MIW dekglaasje moet net een paar millimeter onder dit niveau. Zorg ervoor dat de positionering van het MIW tussen de onderkant schuifdeuren zorgt ervoor dat het dekglaasje (glas gedeelte van de MIW) plat ligt, parallel aan de deuren in de bodem van de doos. Dit zal zorgen voor een goede scherpstelling.
- Laat de microscoop doelstelling, om ruimte te maken voor de plaatsing van het vak optop van de microscoop podium.
- Plaats de doos op de microscoop podium, en pas het podium, zodat het MIW dekglaasje is boven de doelstelling.
- Focus het doel en de start beeldvorming.
- Tijdens het gebruik van isofluraan, moet het dier worden gecontroleerd door visuele inspectie van de ademhaling frequentie. Dit kan visueel worden gedaan, of door controle van de frequentie van de ademhaling artefacten verschijnen tijdens de beeldvorming collectie (deze kunnen interfereren met data-acquisitie). De MouseOx pulsoximetrie systeem (Starr Life Sciences Corp) is met succes gebruikt. Op die manier kunnen de gegevens continu worden verzameld zonder het draaien van de lichten op in de kamer om te controleren op het dier.
Let op: Na elke sessie beeldvorming, dier herstel moet worden gefaciliteerd door het wikkelen van een kleine hand verwarming pad in gaas of kimwipes en zetten het onder het dier in de kooi.
Opmerking: Als een immersie objectief wordt gebruikt om de afbeelding door het MIW, de onderdompeling medium (glycerol, water, olie) moet worden gereinigd uit de imaging-venster. De MIW moet worden gecontroleerd op eventuele scheuren of andere schade die zou kunnen hebben voorgedaan tijdens de beeldvorming. Dit is essentieel voor het verzamelen van gegevens gedurende meerdere beeldvorming sessies.
6. Photoswitching en beeldvorming van Dendra2-gemerkte cellen
De procedure is beschreven voor de Leica SP5 confocale microscoop, het laservermogen op de focal plane, beschikbaar doelstellingen en software-opties variëren bij het gebruik van andere confocale microscopen of multifoton imaging opzetten, en dus het protocol hieronder beschreven moeten worden gebruikt als een leidraad voor het optimaliseren het experiment op uw microscoop.
- Door het observeren van de tumor door het oculair (10x) met de groene fluorescentie filter, zoek grote bloedvaten die zichtbaar zijn vloeiend en plat ligt in hetzelfde brandvlak worden geplaatst.
- Plaats een van de schepen in het midden van het veld en schakel over naar PMT detectie.
- Stel sequentiële imaging inzameling voor twee kanalen. Een van de kanalen gebruikt 488nm laser lijn (10% vermogen), en verzamelt verstrooiing van de extracellulaire matrix (480-495nm) en de emissies uit de groene vorm van Dendra2 (505-540nm). Het tweede kanaal maakt gebruik van de 543nm laser lijn (90% vermogen) en verzamelt emissie uit de rode vorm van Dendra2 (555-600 nm). Verzamel 3D-beelden pre-photoswitching.
- Gebruik maken van de ROI scan optie om een gekozen populatie van cellen met behulp van de 405 nm laser lijn (30% vermogen, 20-40 scans) photoswitch. Verzamel-emissie van de rode vorm van het eiwit aan het schakelen te controleren.
- Met dezelfde sequentiële routine als in 6.3, het verzamelen van post-switching 3D-beelden.
- Indien photoswitching meer dan een regio in de tumor, is het raadzaam om foto's te maken door middel van de lenzen met behulp van een digitale camera, zowel in groen en rood kanalen (Figuur 3A, B). Dit zal helpen bij de oriëntatie tijdens de daaropvolgende beeldvorming sessies.
Opmerking: Ook bloedvaten kan tijdelijk worden geëtiketteerd met staart-ader injecteren van TL-dextran (Cascade Blue of Alexa Fluor 647, beide 10kDa). Een paar uur na de injectie zal dextranen laat de bloedvaten en permanent het etiket van de macrofagen.
Representatieve resultaten:
Figuur 3C toont een rechthoekig photoswitched regio (rood) gericht orthogonaal ten opzichte van het bloedvat (geen fluorescentie). Niet-photoswitched cellen zijn groen, terwijl de verstrooiing van de extracellulaire matrix is paars. Beeld is een maximale intensiteit projectie van vier afbeeldingen langs de Z-as (20-50 micrometer diepte).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Amerikaanse Department of Defense (BC075554 naar BG en BC061403 naar DK), US National Institutes of Health (U54GM064346 naar JvR; CA100324 tot JC, JES en JW; CA77522 aan JES, U54CA126511 naar JC en BG). Wij danken D. Entenberg voor hulp bij microscopie, M. Rottenkolber voor hulp in de fabricage van de imaging-box en J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) voor de F4/80 antilichaam.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS w/o Ca, Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | |
| DMEM media (MDA-MB-231 cells) | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| Isoflurane(Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | # NDC 10019-773-40 | |
| SCID mouse | National Cancer Institute | N/A | |
| Culture dishes | BD Biosciences | 353003 | Custom Order |
| Circular coverslip 8 mm | Scientific, Inc. | 8CIR-1-FIS |
References
- Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein. Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).
- Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis. J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).
- Brown, E. B. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Med. 7, 864-868 (2001).
- Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling. Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).
- Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).
- Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
