Summary
Прижизненные photoswitching и отслеживание Dendra2 меченных клеток опухоли молочной через окно изображений является техника, которая позволяет нам образ метастатическое поведение опухолевых клеток в выбранных микросреды опухоли на шкале времени суток.
Abstract
В последнее десятилетие, прижизненной микроскопии опухолей молочной железы у мышей и крыс в одноклеточных разрешение
Protocol
1. Поколение флуоресцентных опухолей использованием инъекции опухолевых клеток в молочной жировой ткани:
- Рост клеточной линии выражения Dendra2 белка (как цитоплазматические маркера) до 40 - 80% слияния.
- Промыть блюда по крайней мере 3 раза PBS без Са 2 + или Mg 2 +.
- Добавьте 3 мл трипсина на 10 см блюдо и инкубировать при 37 ° С, пока большая часть клетки отделяются, а затем ударил блюдо от плоской поверхности, чтобы поколебать его.
- Тщательно промойте все клетки от блюдо, и использовать скребок (резиновые полицейский) для сбора матрицы, а также. Добавить 5 мл PBS. Возьмите аликвоту рассчитывать во время центрифугирования.
- Центрифуга на 800 г в течение 5 мин.
- Аспирацию и ресуспендируют в PBS в концентрации 5 - 10x 10 6 / мл. Магазин на льду, пока вводят внутривенно (вводят в течение 30 мин).
- Место клетке содержащие 4-5 недели девочка иммунодефицитных мышей (например SCID) внутри стерильного капотом.
- Спрей территории вокруг 4-й (брюшной) соска с 70% этанола.
- Inject 0,1 мл в молочной жировой ткани. Если помощник может быть найден, один человек может держать мышь на месте, пока другие вкладыши иглы внутри молочной жировой ткани. Если вы инъекционных самостоятельно, положить мышь под легкой анестезией использованием изофлуран.
- Как только опухоль выросла до 5-7 мм, молочной Window Imaging (MIW) должны быть вставлены.
Примечание: Кроме того, для некоторых приложений, MIW могут быть вставлены в верхней части здоровой молочной жировой ткани и клетки могут быть введены впоследствии. Такой подход позволяет визуализации временно трансфекции клеток в физиологических окружающей среды.
2. Руководство изготовлению молочной Window Imaging (MIW):
- MIWs (рис. 1А) изготовлены из ткани пластиковых класса для обеспечения биосовместимости. Для ручного строительства, мы используем 5 или 10 см блюда.
- Положите на латексные перчатки.
- Нагрейте ткани культуры блюдо и создавать изогнутые поверхности, нажав округлые, твердый предмет против подогревом блюдо (мы используем 1-дюймовый dremmel бит для этого).
- Вырежьте в центре блюда использованием подогревом лезвия бритвы.
- Используйте небольшие, конической формы бит dremmel, чтобы сделать отверстие в центре куполообразной базы пластиковые (6-7 мм в диаметре).
- Сделать края пластиковой основе совершенно гладкой путем шлифования его dremmel и дальнейшее ее подачи.
- Файл верхней части пластиковой основе решений плоской поверхности для стекла покровное. Диаметр подали, плоская поверхность должна быть 9-10мм.
- Клей 8мм круговой стекло покровное (номер 1) на плоской поверхности с помощью суперклея (цианакрилатного клея).
- Подождите, пока клей застывает (15 минут).
- Используйте подогревом 26G иглу, чтобы сделать восемь ушивание отверстия прокола со стороны (там, где стекло), чтобы внутри базы. Отверстия должны быть равномерно распределены по всему покровное, 0,5-1мм от края покровного стекла.
- Расширить отверстия использованием 5-0 наложения швов иглу.
- Puncturing отверстия в пластиковой основе сделают внутренней поверхности неравномерно. Использование наждачной бумаги, делают это совершенно гладкой поверхности.
- Изменение перчатки и кисть небольших пластиковых частиц из MIW, используя маленькую кисть.
- Вымойте MIW деионизированной водой.
- Вымойте MIW использовании 70% этанола. Использование Q-Tip для чистки стекла, так что она полностью прозрачна. Если Есть туманные пятна подарок от паров клея, тщательно используйте ацетон с Q-Tip.
- Стерилизовать MIW от ультрафиолетового облучения в течение 3 часов с каждой стороны.
Полу-Руководство изготовлении молочной Window Imaging (MIW):
Для изготовления пластиковой основе, мы в настоящее время используют силиконовые формы резиновые литья создается с помощью ручной MIWs. Пресс-форма состоит из двух частей, из силиконового каучука, которые делают точную копию передней и задней оригинальным, когда заполнены с полиэфирной смолой, а затем сразу объединились. Жидкости полиэфирной смолы смешивают вместе 9:10 и приводит к жесткой структурой после полного высыхания в 48 часов. Пластик защитой от ультрафиолетового излучения и архивных без выхода из строя или становятся желтыми с течением времени.
После база вылечить, 2.8-2.16 шаги делаются так же, как для ручного производства MIWs.
3. Введение MIW:
- Территория вокруг 4-го соска должна иметь небольшой (5-7 мм в диаметре) опухоли нескольких дней / недель после введения опухолевых клеток в зависимости от типа клеток (рис. 1В). Сколько времени прошло после инъекции клеток, экспрессирующих Dendra2 photoswitchable белка или других флуоресцентных белков зависит от клеточной линии используются. Опухоль не должно быть заметно некротических и должны иметь неповрежденную кожу с волосами на вершине опухоли. Мыши с некротическими опухолями должны быть умерщвлены.
- Подготовка стерильного пространства для хирургии, сложить кусок стерильной ткани внутри стерильного капотом. Положите кусок стерильной гauze в середине, и лежал несколько MIWs и стерильные инструменты вокруг него: мы используем стандартные небольшие ножницы, весной ножницы, пинцет microdissecting, microdissecting щипцов, иглодержателя. Держите стерильный Q-подсказки, бутылки из 70% этанола и стерильные перчатки в угол капота.
- Мышь анестезией в стерильных капот использованием IP-инъекция 2,5% авэртин (20 мкл / г) в HBSS или, напротив 10 мкг / кг кетамина + 10 мкг / г ксилазина (обратитесь к уходу за животными института согласований и упорядочение).
Примечание: Avertin решение должно быть подготовлено два раза в неделю, фильтр стерилизовать использованием 0,22 мкм фильтр и хранится в виде 500 мкл аликвоты при 4 ° C (в темноте). - Удалить волосы после бритья области над опухолью с помощью небольшого бритвы животного.
- Удалить остальных волос, используя Наир эпиляции кремом (доступны в любой аптеке). Очистите кожу с помощью этанола погружать Q-подсказки.
- Передача животных на стерильную марлю и применять глазной мази для глаз, чтобы держать их от пересыхания и инфекций.
- Стерилизовать кожу бетадин и чистый с 70% этанола.
- Передача животных на хирургический стерильный ткань внутри стерильного капотом.
- Вытяните кожу сразу медиальной к соску использованием щипцов и сократить ~ 2 мм разрез в коже.
- Отдельные основные молочной жировой ткани от кожи, используя рассечение ножницами и щипцами. Кожи и дырки растянуть во время этой стадии разделения до размера, который разместится вставки MIW.
- Если случайно судна пострадали во sugery, используйте стерильные Q-советы для удаления крови, который вырабатывается /, чтобы остановить кровотечение стать чрезмерным.
- Вставьте MIW такое, что существует кожа на верхней части основания MIW и шовные на месте с помощью невсасываемые нить и обратного резки иглы.
- Используйте ткань клеем или цианоакрилат заполнить ушивание отверстия и закрепите MIW к коже.
- Добавить TMP-SMX антибиотик смеси: (Сульфаметоксазол 0,6 мг / мл, Триметоприм 0,12 мг / мл) в бутылку клетке воды в течение 3 дней до и после хирургического вмешательства.
- Животное пребывает под наркозом для 1-4 часа после инъекции IP авэртин. Так как операция обычно занимает ~ 45 мин, важно, чтобы помочь животным восстановиться после этого:
- Место площадку стороны отопления (37 ° С) (имеется в аптеках) на дно клетки и покрыть ее марлей.
- Держите животное в верхней площадке, пока не оказывается на ее живот и начинает ходить.
- Если животное находится в бессознательном состоянии более 3 часов, вводят 0,3 мл HBSS внутрибрюшинно для регидратации.
- Животных разрешено восстановить в течение ближайших 3-4 дней до начала первой сессии изображений происходит.
4. Изображений Box строительство
Визуализации окна уверяет, что MIW сидит квартире, прямо над объектива микроскопа. Это также облегчает температуры и анестезии контроль через постоянный поток воздуха изофлюрана. Коробка выполнена из оргстекла и склеены с использованием пластиковых сварного шва. Он приспособлен для конкретных столик микроскопа и, следовательно, форма ее дна меняется в зависимости от микроскоп используется (На рисунке 2 показана схема коробка устанавливается на столик микроскопа Leica SP5).
Размеры короба в сантиметрах являются L = 11,4 см, W = 7,6 см, высота = 4,4 см (рис. 2А). Дно ящика состоит из полого пластины, 12.7x8.4 см в диаметре, который помещается внутрь столике микроскопа Leica SP5, а две скользящие "двери", 5,7 Х 5,7 cm_each, которые образуют круглое отверстие (D = 2,22 см ) в закрытом состоянии. MIW вписывается в это отверстие. Передняя часть содержит входное отверстие для анестезии доставка в то время как одной из боковых частей содержит выходное отверстие, что приводит к пустоте.
Обратите внимание, что конденсатор и слайдов должны быть устранены до начала размещения окно визуализации.
5. Использование изображений Box
- Место животных под наркозом с изофлуран и применять глазной мази для глаз.
- Прикрепить изофлуран выхлопных газах наркозный аппарат на фронт окне изображения, на внешней стороне вводного отверстия (рис. 2В).
- Прикрепите вторую трубу до выходного отверстия изображение коробки. Эта трубка должна быть приложена к газовый фильтр, а затем в вакууме.
- Откройте коробку крышкой и открытые окна и двери место животного, MIW стороне, обращенной вниз, и раздвижные двери в коробку.
- Держите окна и отрегулировать нижней двери, чтобы база MIW проводится и иммобилизованные между ними. База MIW должны быть на том же уровне, как двери визуализации окна, в то время покровное MIW должно быть всего в несколько миллиметров ниже этого уровня. Убедитесь, что позиционирование MIW между нижней раздвижных дверей гарантирует, что покровное (стеклянные части MIW) лежит плоская, параллельно нижней двери коробку. Это позволит обеспечить надлежащее внимание.
- Нижняя объектива микроскопа, чтобы пространство для размещения поленачало столик микроскопа.
- Место ящик на столике микроскопа, а также настроить стадии так, чтобы покровное MIW выше цели.
- Фокус цель и начать съемки.
- При использовании изофлуран, животное должно контролироваться путем визуального осмотра частота дыхания. Это можно сделать визуально, либо путем мониторинга частоты дыхания артефакты, появляющиеся во время съемки коллекции (это может повлиять на сбор данных). Оксиметрии MouseOx импульсная система (Starr жизни наук Corp) успешно используется. Таким образом, данные могут быть собраны непрерывно без поворота свет в комнате, чтобы проверить на животных.
Примечание: После каждого изображения сессии, животных восстановление должно быть облегчено путем заключения небольших грелку стороны в марлю или kimwipes и положить ее под животное в клетке.
Примечание: Если цель погружения используется для изображения через MIW, иммерсионной среды (глицерин, вода, масло) должны быть очищены от изображения окна. MIW должны быть проверены на наличие трещин или других повреждений, которые могли произойти во время съемки. Это очень важно для сбора данных в течение нескольких сессий визуализации.
6. Photoswitching и визуализации Dendra2-меченых клеток
Процедура описана для Leica SP5 конфокальной микроскопии; мощность лазера в фокальной плоскости, доступные цели и программные варианты меняются при использовании других конфокальных микроскопов или многофотонной изображений создана, и, следовательно, протокол, описанный ниже, должна быть использована в качестве руководства для оптимизации Эксперимент по вашим микроскопом.
- Наблюдая опухоль через окуляр (10x) с зеленым фильтром флуоресценции, найдите крупных кровеносных сосудов, которые заметно течет и прокладки квартиру в той же фокальной плоскости.
- Позиция одного из судов в центре поля и перейти на ФЭУ обнаружения.
- Настройка последовательного коллекцию изображений для двух каналов. Один из каналов использует 488nm лазерной линии (10% мощности), и собирает рассеяния от внеклеточного матрикса (480-495nm) и излучение из зеленой форме Dendra2 (505-540нм). Второй канал используется 543nm лазерной линии (90% мощности) и собирает излучение красной форме Dendra2 (555-600 нм). Сбор 3D изображения предварительно photoswitching.
- Используйте параметр ROI сканирования photoswitch выбрали популяцию клеток использованием лазерной линии 405 нм (30% мощности, 20-40 сканы). Сбор выброс красной форме белка для контроля переключения.
- Используя тот же последовательный рутины как в 6.3, собирать после переключения 3D изображения.
- Если photoswitching более одного региона в опухоли, рекомендуется делать снимки через окуляры с помощью цифровой камеры, как в зеленый и красный каналы (рис. 3А, Б). Это поможет в ориентации во время последующих сессий визуализации.
Примечание: Кроме того, кровеносные сосуды может быть временно помечены использовании хвостовой вены инъекции флуоресцентного декстрана (Каскад Синий или Alexa Fluor 647, как 10kDa). Через несколько часов после инъекции, декстраны оставят кровеносных сосудов и постоянно этикетке макрофагов.
Представитель Результаты:
Рис 3C показывает прямоугольную photoswitched области (красный), ориентированных ортогонально относительно кровеносных сосудов (без флуоресценции). Номера для photoswitched клетки зеленый, в то время как рассеяние от внеклеточного матрикса, сиреневый. Изображение максимального проекции интенсивности четыре изображения по Z-оси (20-50 мкм глубина).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Министерством обороны США (BC075554 к BG и DK BC061403 к), американского Национального института здоровья (U54GM064346 к JVR; CA100324 по х, JES и JW; CA77522 на JES, U54CA126511 по х и BG). Мы благодарим Д. Entenberg за помощью микроскопии, М. Rottenkolber за помощь в изготовлении окна с изображениями и Дж. Поллард (Альберт Эйнштейн медицинский колледж) для F4/80 антител.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS w/o Ca, Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | |
| DMEM media (MDA-MB-231 cells) | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| Isoflurane(Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | # NDC 10019-773-40 | |
| SCID mouse | National Cancer Institute | N/A | |
| Culture dishes | BD Biosciences | 353003 | Custom Order |
| Circular coverslip 8 mm | Scientific, Inc. | 8CIR-1-FIS |
References
- Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein. Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).
- Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis. J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).
- Brown, E. B. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Med. 7, 864-868 (2001).
- Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling. Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).
- Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).
- Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
