Summary
Ubiquitinação é uma modificação fundamental posttranslational realizado por um conjunto de três enzimas. Mutações dos genes envolvidos nesta modificação estão associadas com diferentes tipos de doenças humanas. Aqui, descrevemos os protocolos para detectar ubiquitinação de proteínas em células cultivadas
Abstract
Ubiquitinação, a ligação covalente da ubiquitina polipeptídeo como alvo as proteínas, é uma modificação fundamental posttranslational realizado por um conjunto de três enzimas. Eles incluem a ativação da enzima ubiquitina-E1, E2 conjugando ubiquitina-enzima, e E3 ubiquitina ligase. Ao contrário de E1 e E2, E3 ubiquitina ligases especificidade substrato mostrar. Por outro lado, numerosas enzimas deubiquitylating têm funções no processamento de proteínas poliubiquinadas. Ubiquitinação pode resultar em mudança de estabilidade da proteína, localização celular e atividade biológica. Mutações de genes envolvidas na via ubiquitinação / deubiquitination ou função alterada do sistema ubiquitina estão associadas com diversas doenças humanas, como vários tipos de cancer, neurodegeneração, e distúrbios metabólicos. A detecção de ubiquitinação alterado ou normal de proteínas-alvo pode fornecer uma melhor compreensão sobre a patogênese dessas doenças. Aqui, descrevemos os protocolos para detectar ubiquitinação de proteínas em células cultivadas
Protocol
Detecção de ubiquitinação de proteínas em células cultivadas
- Transfecção as células cultivadas com plasmídeos expressando a proteína de interesse e (epítopo-tagged versão) ubiquitina.
- Faça lise completa das células (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) com 2mM ortovanadato de sódio, 50 mM de fluoreto de sódio, e os inibidores da protease.
- Lisar células com 100 mL de buffer de células por placa de lise (6 prato cm). Se uma antena maior é usado, ajustar o volume em conformidade. Redemoinho o prato com cuidado para deixar o tampão de lise cobrir toda a área de células cultivadas.
- Coletar as células com um raspador de celular e transferir os lisados celulares em um tubo eppendorf 1,5 ml. Colocar o tubo em um prato quente imediatamente para ferver por 10 min.
- Cisalhamento as células com um dispositivo de sonicação.
- Adicionar 900ul de tampão de diluição (10 Triton mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1%). Incubar as amostras a 4 ° C por 30-60 min com rotação.
- Spin the amostras diluídas em 20.000 xg por 30 min. Transferir o sobrenadante resultante para um tubo eppendorf novo. Tenha cuidado para não perturbar o sedimento.
- Medir a concentração de proteína.
- Prepare a proteína A ou G-agarose anticorpos bead-conjugada contra a proteína-alvo em um buffer compatível (50% de lama). Corte a parte mais estreita de uma ponta P-200 pipeta e transferir 14-20 mL de resina para 500-1,500 mg de lisados celulares preparados para imunoprecipitação. Para as células com eficiência de transfecção alta, 500 mg será suficiente. Para as células com eficiência de transfecção baixo, mais proteínas pode ser necessária.
- Incubar a mistura de células-lisado talão a 4 ° C durante a noite com rotação.
- Spin para baixo as contas em 5000 xg por 5 min. Aspirar o sobrenadante. Lavar a resina com o tampão de lavagem (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) duas vezes.
- Girar a contas pela última vez em 20.000 xg por 30 seg. Aspirar a solução de lavagem residual e ferva a resina com 2X tampão de carregamento SDS.
- Carregar amostras em um gel SDS-PAGE immunoblotting para análise.
- Detectar ubiquitina ea proteína-alvo com anticorpos respectivos. Para immunoblotting, geralmente detectar ubiquitina primeiro. A membrana, então, ser usado para detectar a proteína precipitada.
Detecção de ubiquitinação de proteínas-alvo por meio de ensaio in vitro ubiquitinação
- Faça buffer de ubiquitinação 5X (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 25 mM MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM ATP). Armazená-los em pequenas alíquotas a -20 ° C por até 6 meses. Alguns protocolos também adicionar fosfato de creatina e creatina quinase no buffer de ATP 1,2 regeneração.
- Para cada reação, prepare uma mistura contendo o seguinte:
Como controles, prepare reações similares na ausência de qualquer E1, E2, ou ubiquitina.8 mL 5X tampão ubiquitinação 250 ng ubiquitinação E1 500 ng ubiquitinação E2 0,5 mg ubiquitina 0,5 mg proteína de interesse água a 40 mL de volume total de - Incubar a mistura a 37 ° C por 1 hora ou mais.
- Parar a reacção adicionando SDS-PAGE tampão de amostra e ferva a amostra por 10 min.
- Carregar amostras em gel SDS-PAGE immunoblotting para análise.
- Detectar ubiquitina ea proteína-alvo com anticorpos respectivos.
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Discussion
Nesta apresentação, descrita pela primeira vez os passos que permitem a detecção de modificação ubiquitina em uma proteína de interesse em culturas de células de mamíferos. A fim de detectar ubiquitinação especificamente sobre a proteína de interesse, e não sobre proteínas não-covalentemente interagindo, usamos uma condição rigorosos para a lise celular, imunoprecipitação e lavagem 1,3. Ubiquitinação, detectadas por imunoprecipitação de proteínas-alvo em uma condição tão dura seguido de anti-ubiquitina immunoblotting, é provável que ser específicos para a proteína alvo. Para evitar deubiquitination proteína durante os procedimentos experimentais, os inibidores da enzima deubiquitinating tais como N-etilmaleimida e aldeído ubiquitina pode ser adicionado a todos os buffers 4. No entanto, é improvável que as enzimas permanecem ativas deubiquitination após 10 min processo de ebulição. Manchas fortes ou escadas de alta espécies moleculares são tipicamente o resultado de ubiquitinação. O grau de ubiquitinação da proteína de interesse pode ser avaliada comparando a proporção de proteína-alvo ubiquitinated / sem modificações em várias condições experimentais. Enquanto isso, as moléculas de ubiquitina livre são geralmente reduzidos quando ubiquitinação da proteína alvo é aumentada. Este protocolo também é útil para detectar outras ubiquitina-like modificação pequena molécula, como sumolyation e neddylation.
Nós também descrito um ensaio in vitro utilizando ubiquitinação proteínas purificadas ou recombinantes. Vários componentes epítopo-tagged ubiquitinação estão disponíveis comercialmente. Ligase E3 ubiquitinação não é necessária para a conjugação da ubiquitina in vitro.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede RO1 DC006497, RO1 NS057289, e PO1 ES016738 (a Z. Zhang); California Institute de Medicina Regenerativa concede RS1-00331-1 e RL1-00682-1 (a Z. Zhang), a americana Parkinson doença Association (a Z. Zhang e Choo YS) e do Michael J. Fox Foundation for Research Parkinson (Z. Zhang).
References
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