Summary
في هذه الورقة ، ووصف لنا طريقة نموذجية لعزل والثقافة myocytes الكبار قلب الفئران. وتستخدم كولاجيناز البروتيني لهضم وعزل myocytes واحد. Myocytes مثقف اتبع هذا البروتوكول تلبية الاحتياجات الأكثر تجربة.
Abstract
مثقف القوارض خلايا البالغين قلب نظام الأساسي ونموذجا هاما للبحوث القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، يمكن إنشاء وقابلة للحياة قوية myocytes الكبار مثقف أن يكون تحديا تقنيا ، ومعدل منظم الخطوة لكثير من الباحثين. وصف نحن هنا بروتوكولا للحصول على غلة عالية من البالغين myocytes قلب الفئران التي لا تزال قابلة للحياة في الثقافة لعدة أيام. معزول القلب وperfused مع كولاجيناز والبروتيني منخفض تحت كا
Protocol
إعداد الجزء الأول للجراحة
- قبل يوم من الجراحة الفئران ، تأكد أن جميع الحلول ، ولكنها لا تضيف أي الانزيمات حتى الان. يجب على جميع المخازن ألف وباء ، وغسل العازلة تتم تصفيته للعقم قبل التخزين. يجب على جميع المخازن المؤقتة يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية.
- يجب أن تكون مطلية 6 لوحات زراعة الأنسجة بشكل جيد مع 10-20 ميكروغرام / مل في laminin 1XSFM مل (2) وقبل يوم وكذلك ، ويجب أن يتم تخزينها في 37 درجة مئوية في حاضنة 2 CO.
- في يوم من الجراحة ، وإعداد الأدوات الجراحية بواسطة تعقيم المشبك ، مقص ، وملقط مع الايثانول 70 ٪ والسماح لهم الجاف على منشفة ورقية.
- يتم إجراء حقنة مليئة 1 مل 0.5 مل من محلول الهيبارين (90 يو / مل) جاهزة.
- الآن هو الممارسة السليمة لغسل الجهاز الارواء عن طريق تشغيل من خلال الايثانول 70 ٪ ، وذلك باستخدام مضخة تمعجية في الاتجاه المعاكس. بمجرد الانتهاء الشطف مع الإيثانول ، شطف مع الماء المقطر جهاز مزدوج ، وأخيرا مع شطف ألف الاحتياطي تدفق من خلال تجمع في كوب توضع في حمام مائي 37 ° C.
- لإعداد جهاز نضح تنظيفها ، وملء الأنبوب حقنة الحق مع 40 مل من الاحتياطي ألف والمحاقن أنبوب اليسار مع 40 مل من الاحتياطي B.
- رئيس الأنبوب نضح لغيض من القسطرة عن طريق السماح الاحتياطي ألف إلى تدفق من خلال اجهزتها. الملء إلى المخزن المؤقت للحقنة إلى مستوى 40 مل. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء المحتبسة في الأنبوب بعد هذه الخطوة.
- الآن ، أغلق العازلة صمام محبس حقنة وتكرار هذه العملية مع B الاحتياطي بحيث يتم تستعد الآن للأنابيب العازلة نضح مع باء
- أخيرا ، بقي الجهاز الارواء مع B الاحتياطي فتح صمام محبس ، ولكن مع توقف تدفق باستخدام منظم على خط الرابع.
- تجاهل العازلة على الرغم من التدفق في الدورق جمع.
- آخر شيء يجب القيام به قبل الجراحة هو اضافة الانزيمات اللازمة لمحلول المخزون الخاص بك ، ومن ثم تصفية حل انزيم تماما كما كانت الحلول الأخرى التي تمت تصفيتها في اليوم السابق. تصفيتها مرة ، يمكن ترك هذا الحل في درجة حرارة الغرفة.
الجزء الثاني. تشريح الجرذ القلب
- بروتوكول قياسي بعد الموت ببطء الفأر مع Isoflurane في غرفة الغاز.
- تعقيم منطقة شق في الصدر مع الايثانول 70 ٪.
- فتح صدره وباستخدام مقص كشف القلب.
- ضخ البطين الأيسر مع 0.5 مل من محلول الهيبارين (90 يو / مل).
- القلب مع إزالة جزء كبير من الشريان الأورطي سليمة ، في مكان مؤقت باء الجليد الباردة
الجزء الثالث. Myocytes العزلة
- وينبغي أن يكون قلب فأر نموذجية تسفر عن جزء كبير من قضيب على شكل myocytes (على العكس من خلايا ميتة مدورة) إذا تم الالتزام بها بشكل صحيح إلى الإجراء التالي.
- لتبدأ ، المشبك الأبهر إلى القسطرة. لا ينبغي للطرف القسطرة يتم دفع بعيدا جدا في قلب لضمان التروية الجيدة للقلب عن طريق الشريان التاجي.
- فرضت مرة واحدة ، التعادل الأورطى إلى القسطرة مع خياطة.
- المقبل ، فتح خط الرابع المنظم للسماح بمعدل سريع بالتنقيط (~ 60 قطرات / دقيقة) ، والسماح ب العازلة لتغسل القلب.
- أثناء غسل B الاحتياطي ، استخدام مقص صغير وملقط لإزالة أي الأذينين والأنسجة الدهنية أو الرئة التشبث القلب.
- بعد الانتهاء من الاحتياطي B ، والتحول إلى تدفق ألف العازلة
- في حين يسمح للمخزن في التدفق لمدة 5 دقائق ، ينبغي تنفيذ المهام الصغيرة عدة بسرعة.
- أولا ، دافئة الحل أنزيم في حمام ماء C ° 37.
- أخيرا ، عندما يتم استنفاد الاحتياطي A من الحقنة (ولكن لا تزال موجودة في الأنبوب) ، تحميل 50 مل من محلول أنزيم في حقنة ألف من جهاز نضح
- فقد بات من الضروري لتجاهل كل من التدفق من خلال جمع الدورق في حمام مائي (بواسطة pipetting) ، حتى في قلب الحل perfuses الانزيم.
- بمجرد حلول perfuses أنزيم في القلب ، تنشيط مضخة تمعجية التي تم إعدادها لنقل الحل الانزيم من الدورق جمع ألف حقنة لتجديد
- انزيم يسمح الحل تتدفق في القلب لمدة 10 دقيقة. كما يساعد على هضم القلب ، فإنه يبدأ النظر المتضخمة.
- إضافة 37.5 ميكرولتر من 0.1 م 2 CaCl في حل الانزيم في حقنة وإعطاء التركيز الفعال لكا 2 + 0.1 ملم.
- بعد 10 دقيقة زيادة تركيز الكالسيوم إلى 0.2 ملي بإضافة مبلغ إضافي 50 ميكرولتر من CaCl م 2 إلى 0،1 ألف حقنة ، والسماح للنضح المضي قدما لمدة 10 دقائق أخرى.
- قطع ونقل إلى البطينين دورق معقمة صغيرة تحتوي على 20 مل من محلول أنزيم.
- في الدورق زيادة تركيز الكالسيوم إلى 0.4 ملي وذلك بإضافة 40 ميكرولتر أكثر من 0.1 م CaCl 2.
- اللحم المفروم برفق القلب إلى 10 أو أكثر من قطعة مع زوج من مقص صغير العقيمة.
- احتضان الكأس لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية مع هزاز لطيف.
- إضافة 40 مل من CaCl م 2 إلى 0.1إعطاء التركيز الفعال لكا 2 + 0.6 مليمتر ومتمزج بلطف القطع القلب مع الماصة نقل البلاستيك 3-5 مرات.
- بعد حضانة لمدة 5 دقائق إضافية عند 37 درجة مئوية ، إضافة 40 مل من 0.1 م 2 CaCl متمزج بلطف وكما حدث من قبل.
- myocytes منفصلة واحدة من المنظمات غير مهضوم مهضوم النسيج الضام باستخدام الترشيح من خلال شبكة العقيمة ميكرومتر 500.
- السماح للخلايا ليستقر في أنبوب 50 مل لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- طاف مع تجاهل نقل الماصة.
- resuspend بلطف الخلايا في مخزن # 1 اغسل وتسمح للخلايا لتسوية لمدة 10-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- في حين أن الخلايا هي تسوية ، واتخاذ قسامة الصغيرة ، واستخدام هذا الوقت فرصة لتقييم جودة وسلامة الخلايا في تعليق تحت مجهر مقلوب. وسوف التحضير الجيد لها نسبة عالية (> 80 ٪) من قضيب مثل الخلايا مع التصدعات هش.
- مرة واحدة في الخلايا قد استقروا ، تجاهل الخلايا وطاف resuspend برفق في مخزن اغسل # 2. السماح للخلايا يستقر عند درجة حرارة الغرفة ، والتي ينبغي أن تأخذ مرة أخرى 10-20 دقيقة ، وتجاهل طاف.
- تكرار عملية الغسيل ومرة أخرى مع الاحتياطي اغسل # 3 ، وخلايا يكون جاهزا للثقافة.
الجزء الرابع. الخلية العضلية الثقافة
- resuspend بلطف خلايا في وسائل الاعلام المصل 5 ٪. قبل نقل الخلايا لوحات زراعة الأنسجة ، وتغسل الصحون مع 1X SFM. نقل الخلايا في مناطق ذات كثافة المطلوبة واحتضان ثاني أكسيد الكربون في الأنسجة 2 ثقافة حاضنة لمدة 3-5 ساعات.
- تبديل وسائل الإعلام لSFM 1X.
- يمكن أن يكون مثقف الخلايا لمدة تصل إلى أربعة أيام ، واستخدمت على النحو المطلوب لإجراء التجارب.
الجزء الخامس الممثل النتائج / نتائج
يجب أن يكون هناك أكثر من 70 ٪ myocytes القلب يعيش تحت المجهر المقلوب عندما يتم البروتوكول بشكل صحيح.
الجدول رقم 1 : وصفة الحل : 1 L 10X كا 2 + خالية من الاحتياطي KH :
| كتلة | التركيز النهائي | |
| كلوريد الصوديوم | ز 68.96 | 1180 ملي |
| بوكل | 3.58 ز | 48 ملم |
| HEPES | ز 59.58 | 250 ملم |
| K 2 4 هبو | 2.85 ز | 12.5 ملم |
| MgSO 4 | 3.08 ز | 12.5 ملم |
الجدول 2 : وصفة لحلول الاحتياطي L 1 ج :
إضافة 1،98 ز الجلوكوز إلى 100 مل العازلة KH 10X وتقديمهم إلى الحجم النهائي من 1 L. ضبط الأسمولية إلى حالة فسيولوجية قرب (~ 300) مع الجلوكوز. يرتفع الى 7.4 درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم.
| -- | كتلة | التركيز النهائي |
| 10X KH العازلة | 100 مل | 100 مل |
| جلوكوز | 1.98 ز | 11 ملم |
| جلب إلى 1 L | ||
| يرتفع الى 7.4 درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم | ||
| الأسمولية لضبط حالة فسيولوجية قرب (~ 300) مع الجلوكوز. | ||
الجدول 3 : وصفة الحل لأنزيم المخازن
| كتلة | التركيز النهائي | |
| كولاجيناز النوع الثاني | 25 ملغ | 0.05 ٪ (W / V) |
| البروتيني الرابع عشر | 10 ملغ | 0.02 ٪ (W / V) |
| BDM | 0،025 ز | 5 ملم |
| كارنيتيني | 0،020 ز | 2 ملم |
| توراين | 0،031 ز | 5 ملم |
| حمض الجلوتاميك | 0،020 ز | 2 ملم |
| 0.1 م 2 CaCl | 12.5 UL | 25 UM |
| والعازلة | لملء 50 مل |
الجدول 4 : وصفة الحل لBDM 25X / توراين / جيش صرب البوسنة (B / T / B)
| كتلة | التركيز النهائي | |
| BDM | 0،076 ز | 125 ملم |
| توراين | 0،094 ز | 125 ملم |
| BSA | 0.1 ٪ (W / V) | |
| والعازلة | ملء إلى 6 مل |
الجدول 5 : وصفة لحلول B العازلة والمخازن اغسل
| العازلة : | B | # 1 | # 2 | # 3 |
| إضافة : | ||||
| 0.5 م 2 CaCl | 0.4 مل | 0.1 مل | 0.125 مل | 0.15 مل |
| نهائي تركيز CaCl 2 | 1 ملم | 1 ملم | 1.25 مم | 1.5 ملم |
| 25X B / T / B | --- | 2 مل | 2 مل | 2 مل |
| العازلة وحدة تخزين إلى النهائي | 200 مل | 50 مل | 50 مل | 50 مل |
الجدول 6 : وصفة الحل للاعلام التثقيف
| 2X المصل خالية من وسائل الإعلام (SFM) | ||
| التركيز النهائي | ||
| (بعد التخفيف) | ||
| كارنيتيني | 0،099 ز | 10 ملم (5 ملم) |
| توراين | 0،063 ز | 10 ملم (5 ملم) |
| الكرياتين | 0،075 ز | 10 ملم (5 ملم) |
| مضاد حيوي / مضاد فطري | 0.5 مل | 1 ٪ (0.5 ٪) (V / V) |
| وسائل الإعلام 199 | 45 مل | لملء 50 مل |
| 1X SFM | ||
| التركيز النهائي | ||
| 2X SFM | 25 مل | 1X |
| وسائل الإعلام 199 | لملء 50 مل | |
| 1X الإعلام المصل 5 ٪ | ||
| التركيز النهائي | ||
| 2X SFM | 25 مل | 1X |
| FBS | 2.5 مل | 5 ٪ (V / V) |
| وسائل الإعلام 199 | لملء 50 مل |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والخطوة الحاسمة هي السرعة التي معلوق قلب معزولة حتى على نظام الارواء. ربما لطول فترة الهضم الأنزيمي تكون مختلفة قليلا عن كل فأر. التعديل يتوقف على مدى اللين قلب يصبح بعد فترة العادية الهضم. الانتعاش ببطء من كا 2 + بعد الهضم انزيم ضروري للحصول على الكالسيوم 2 + التي تتحمل الخلايا السليمة.
لخنزير غينيا ، والبروتوكول هو نفسه ما عدا يستخدم بدلا من الرابع عشر هيالورونيداز البروتياز. عادة ، فإننا نجد أن النسبة المئوية الأولي للخلايا الحية هي أقل بالنسبة للخنازير غينيا بالمقارنة مع الفئران ، والبقاء على قيد الحياة على الرغم من أنها بعيدة تماما كما في الثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P9666 | |
| MgSO4 | Fluka | 63068 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C3630 | |
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | |
| Media 199 | GIBCO, by Life Technologies | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | |
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | |
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. akahashi, Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
