Summary
In dit artikel beschrijven we een typische manier om te isoleren en cultuur volwassen ratten hart myocyten. Collagenase en protease worden gebruikt voor het verteren en te isoleren single myocyten. Myocyten gekweekte volgen van dit protocol voldoen aan de meeste eisen experiment.
Abstract
Gekweekte primaire volwassen knaagdieren hart-cellen zijn een belangrijk model voor cardiovasculair onderzoek. Toch kunnen stellen en daarvoor solide, levensvatbare gekweekte volwassen myocyten wordt een technisch uitdagende, snelheidsbeperkende stap voor vele onderzoekers. Hier hebben we beschreven een protocol om een hoge opbrengst van volwassen ratten hart myocyten dat levensvatbaar te blijven in de cultuur gedurende enkele dagen te verkrijgen. Het hart is geïsoleerd en geperfuseerd met collagenase en protease onder lage Ca
Protocol
Deel I. Voorbereiding voor een operatie
- De dag voor de rat operatie, er zeker van dat alle oplossingen worden gemaakt, maar nog geen enzymen. Buffers A, B en de wasbuffer moeten alle worden gefilterd voor steriliteit voorafgaand aan de opslag. De buffers moeten allemaal worden bewaard bij 4 ° C.
- 6-well kultuurplaten moeten worden bedekt met 10-20 ug / ml laminine in 2 ml 1XSFM de dag ervoor ook, en moet worden bewaard bij 37 ° C in een CO 2 incubator.
- Op de dag van de operatie, de voorbereiding van de chirurgische instrumenten door het steriliseren van de klem, schaar, pincet en met 70% ethanol en laat ze drogen op keukenpapier.
- Een 1 ml spuit met 0,5 ml Heparine-oplossing (90 U / ml) is gereed gemaakt.
- Nu is het een goede gewoonte om de perfusie apparaat te wassen door het uitvoeren van door middel van 70% ethanol, met behulp van de peristaltische pomp in omgekeerde volgorde. Eenmaal klaar spoelen met ethanol, spoel het apparaat met dubbel gedestilleerd water, en ten slotte spoelen met buffer A. De stroming door wordt opgevangen in een bekerglas geplaatst in een 37 ° C waterbad.
- Ter voorbereiding op de gereinigde perfusie apparaat, vul de juiste spuit buis met 40 ml buffer A en de linker buis spuit met 40 ml buffer B.
- Prime de perfusie slang aan op de tip van de katheter doordat Buffer A te laten stromen door de inrichting. Vullen van de buffer A spuit om de 40 mL niveau. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen opgesloten in de slang na deze stap.
- Nu, in de buurt van de buffer A spuit kraan klep en herhaal het proces met buffer B zodanig dat de perfusieslang nu is geprimed met Buffer B.
- Ten slotte wordt de perfusie apparaat links met de buffer B kraan klep open, maar met de stroom mee gestopt met behulp van de regelaar op de IV lijn.
- Gooi de buffer flow-maar in het verzamelen beker.
- Het laatste wat je moet doen voor de operatie is om de benodigde enzymen toe te voegen aan uw voorraad-oplossing, en vervolgens filter het enzym oplossing net als de andere oplossingen werden gefilterd de dag voordien. Eenmaal gefilterd, kan deze oplossing bij kamertemperatuur.
Deel II. De Rat hart dissectie
- Na standaardprotocol euthanaseren de rat met Isofluraan in een gaskamer.
- Steriliseer de incisie gebied op de thorax met 70% ethanol.
- Open kist met een schaar en bloot hart.
- Injecteren linker ventrikel met 0,5 ml Heparine-oplossing (90 U / ml).
- Verwijder hart met groot deel van de aorta intact, plaats in de ijskoude buffer B.
Deel III. Myocyten isolatie
- Een typisch rat hart moet opleveren een grote fractie van staafvormige myocyten (in tegenstelling tot dode afgeronde cellen) als aan de volgende procedure goed is gevolgd.
- Om te beginnen, klem aorta naar de katheter. Het uiteinde van de katheter moet niet te ver worden geschoven in het hart een goede doorbloeding van het hart te waarborgen door de kransslagader.
- Eens vastgeklemd, das de aorta van de katheter met een hechting.
- Open vervolgens de IV lijn regulator om een snelle druppelsnelheid (~ 60 druppels / min) toe te staan en Buffer B laten wassen het hart.
- Tijdens de Buffer B wassen, gebruik maken van de kleine schaar en pincet om de atria en de eventuele vettige of longweefsel klampt zich vast aan het hart te verwijderen.
- Nadat Buffer B is voltooid, schakelt de stroom naar buffer A.
- Terwijl de Buffer A is toegestaan om stroom voor 5 minuten moet met een aantal kleine taken snel worden uitgevoerd.
- De eerste, warm de Enzyme oplossing in een 37 ° C waterbad.
- Ten slotte, wanneer Buffer A is uitgeput uit de spuit (maar nog steeds aanwezig in de slang), load 50 mL van het enzym oplossing in spuit A van de perfusie apparaat
- Het is nu noodzakelijk om leggen alle doorstroom uit de collectie beker in het waterbad (door pipetteren), totdat de enzymoplossing perfuses hart.
- Zodra de enzymoplossing het hart perfuses, het activeren van de peristaltische pomp die is opgezet om het enzym oplossing overdracht van de beker het verzamelen van de spuit te vullen A.
- Laat het enzym oplossing door het hart stroom gedurende 10 minuten. Als het hart verteert, het begint te kijken opgeblazen.
- Voeg 37,5 pi van 0,1 M CaCl 2 tot en met het enzym oplossing in spuit A tot een effectieve concentratie van 0,1 mM Ca 2 + geven.
- Na 10 minuten verhogen de concentratie van calcium tot 0,2 mM door het toevoegen van een extra 50 pi van 0,1 M CaCl 2 tot en met spuit A en laat de perfusie te gaan voor nog eens 10 minuten.
- Snijd de ventrikels en over te dragen aan een kleine steriele bekerglas met 20 ml Enzyme Solution.
- In de beker verhoging van de calcium concentratie tot 0,4 mM door de toevoeging van 40 ul van meer 0,1 M CaCl 2.
- Voorzichtig gehakt het hart in 10 of meer stukken met een paar kleine steriele schaar.
- Incubeer de beker gedurende 5 minuten bij 37 ° C met zachte wiegen.
- Voeg 40 ml 0,1 M CaCl 2 tot en metgeven effectieve concentratie van 0,6 mM Ca 2 + en voorzichtig het hart stukken vermaal met een plastic overdracht pipet 3-5 keer.
- Na het incuberen voor nog eens 5 minuten bij 37 ° C, 40 ml van 0,1 M CaCl 2 toe te voegen en voorzichtig vermaal als voorheen.
- Aparte verteerd single myocyten van niet-verteerd bindweefsel met behulp van filtratie door middel van een steriele 500 um mesh.
- Laat de cellen in een 50 ml buis genoegen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi supernatans met een transfer pipet.
- Voorzichtig hersuspenderen cellen in Wash Buffer # 1 en laat de cellen om zich te vestigen gedurende 10-20 minuten bij kamertemperatuur.
- Terwijl de cellen regelen, neem dan een kleine hoeveelheid, en deze keer gebruiken als een mogelijkheid om de kwaliteit en levensvatbaarheid van de cellen in suspensie te beoordelen onder een omgekeerde microscoop. Een goede voorbereiding zal ook een groot gedeelte (> 80%) van de staaf, zoals cellen met heldere strepen.
- Zodra de cellen hebben zich gevestigd, gooi het supernatant en voorzichtig resuspendeer cellen in Wash Buffer # 2. Laat de cellen af te wikkelen bij kamertemperatuur, zou dat opnieuw nemen 10-20 minuten, en gooi het supernatant.
- Herhaal het wasproces eens meer met Wash Buffer # 3, en de cellen klaar zal zijn voor cultuur.
Deel IV. Myocyte celcultuur
- Voorzichtig hersuspenderen cellen in 5% Serum Media. Voor de overdracht van de cellen om weefselkweek platen, was de platen met 1x SFM. Overdracht van de cellen op een gewenste dichtheid en incuberen in een CO 2 weefselkweek incubator gedurende 3-5 uur.
- Schakel de media om 1x SFM.
- Cellen kunnen worden gekweekt voor maximaal vier dagen en wordt gebruikt als nodig is voor experimenten.
Deel V. Vertegenwoordiger Resultaten / Resultaat
Er moet meer dan 70% van het levende hart myocyten in omgekeerde microscoop als het protocol goed wordt gedaan.
Tabel 1: Oplossing recept voor een L 10X Ca 2 +-free KH Buffer:
| massa | Uiteindelijke concentratie | |
| NaCl | 68,96 g | 1180 mm |
| KCl | 3,58 g | 48 mM |
| HEPES | 59,58 g | 250 mM |
| K 2 HPO 4 | 2,85 g | 12,5 mM |
| MgSO 4 | 3,08 g | 12,5 mM |
Tabel 2: Oplossing recept voor een L Buffer A:
Voeg 1,98 g glucose tot 100 ml 10X KH buffer en breng aan de uiteindelijke volume van 1 L. Pas osmolariteit tot bijna fysiologie conditie (~ 300) met glucose. Breng op pH 7,4 met NaOH.
| - | Massa | Uiteindelijke concentratie |
| 10X KH Buffer | 100 ml | 100 ml |
| Glucose | 1,98 g | 11 mM |
| Breng aan een L | ||
| Breng aan de pH 7.4 met NaOH | ||
| Stel osmolariteit tot bijna fysiologische toestand (~ 300) met glucose. | ||
Tabel 3: Oplossing recept voor Enzyme Buffers
| massa | Uiteindelijke concentratie | |
| Collagenase type II | 25 mg | 0,05% (w / v) |
| Protease XIV | 10 mg | 0,02% (w / v) |
| BDM | 0,025 g | 5 mM |
| Carnitine | 0,020 g | 2 mM |
| Taurine | 0,031 g | 5 mM |
| Glutaminezuur | 0,020 g | 2 mM |
| 0.1 M CaCl 2 | 12,5 uL | 25 uM |
| Buffer A | Vullen tot 50 ml |
Tabel 4: Oplossing recept voor 25X BDM / Taurine / BSA (B / T / B)
| massa | Uiteindelijke concentratie | |
| BDM | 0,076 g | 125 mM |
| Taurine | 0,094 g | 125 mM |
| BSA | 0,1% (w / v) | |
| Buffer A | Vullen tot 6 ml |
Tabel 5: Oplossing recept voor Buffer B en Wash Buffers
| Buffer: | B | # 1 | # 2 | # 3 |
| Voeg toe: | ||||
| 0.5 M CaCl 2 | 0,4 ml | 0,1 ml | 0,125 mL | 0,15 mL |
| Uiteindelijke concentratie van CaCl 2 | 1 mM | 1 mM | 1,25 mM | 1.5 mM |
| 25X B / T / B | --- | 2 mL | 2 mL | 2 mL |
| Buffer A tot eindvolume | 200 ml | 50 ml | 50 ml | 50 ml |
Tabel 6: Oplossing Recept voor het kweken van Media
| 2X Serum-vrij Media (SFM) | ||
| Uiteindelijke concentratie | ||
| (Na verdunning) | ||
| Carnitine | 0,099 g | 10 mm (5 mM) |
| Taurine | 0,063 g | 10 mm (5 mM) |
| Creatine | 0,075 g | 10 mm (5 mM) |
| Antibiotica / Antimycoticum | 0,5 ml | 1% (0,5%) (v / v) |
| Media-199 | 45 ml | Vullen tot 50 ml |
| 1X SFM | ||
| Uiteindelijke concentratie | ||
| 2X SFM | 25 ml | 1X |
| Media-199 | Vullen tot 50 ml | |
| 1X 5% Serum Media | ||
| Uiteindelijke concentratie | ||
| 2X SFM | 25 ml | 1X |
| FBS | 2,5 ml | 5% (v / v) |
| Media-199 | Vullen tot 50 ml |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een kritische stap is de snelheid waarmee de geïsoleerde hart wordt opgehangen op het perfusie-systeem. De lengte van de enzymatische vertering periode kan een beetje verschillend voor elke rat. De aanpassing is afhankelijk van hoe zacht het hart wordt na de reguliere periode van de spijsvertering. De langzaam herstel van de Ca 2 + na-enzym digestie is essentieel voor het verkrijgen van Ca 2 +-tolerante gezonde cellen.
Voor de cavia, het protocol is hetzelfde, behalve hyaluronidase wordt gebruikt in plaats van Protease XIV. Normaal gesproken vinden we het dat de initiële percentage van levende cellen is lager voor cavia in vergelijking met ratten, maar ze overleven net zo lang in cultuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P9666 | |
| MgSO4 | Fluka | 63068 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C3630 | |
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | |
| Media 199 | GIBCO, by Life Technologies | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | |
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | |
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. akahashi, Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
